解迎双 张欢 王新潮 白兴斌 刘兰霞 寇宗红 王溪桥

Abstract A rapid screening method for 27 different polar veterinary drug residues in livestock and poultry meat was established by using Sin-QuEChERS Nano column and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). By comparing the purification efficiency of the target compound by Sin-QuEChERS Nano method, Quechers method and solid phase extraction method, the recovery rate of Sin-QuEChERS Nano method was higher than that of the other two purification methods, ranging from 85% to 112.5%. The results showed that the linear correlation of the target was good in the linear range, the correlation coefficient was 0.9986-0.9999, the detection limit was 0.1-1.0 μg/kg, and the quantitative limit was 0.5-3.0 μg/kg. The recoveries of target compounds were 85.0%-112.5% and RSD was 1.6%-8.2% at low, middle and high levels, Compared with the solid phase extraction method and QuEChERS method, this method has the characteristics of simple operation, rapid detection, effective and reliable, and has more practical application value. Therefore, the method can be used to detect more kinds of veterinary drug residues, and can be used to detect other types of samples.

Keywords Sin-QuEChERS Nano purification column; UPLC-MS/MS; veterinary drug residues; rapid screening

动物源性食品（畜禽肉）是人类获取动物性蛋白质的主要来源之一^[1-2]，近几年动物源性食品的消费呈现逐年递增的趋势^[3-4]。然而某些养殖户以促进牲畜生长为目的滥用、误用兽药，从而威胁人类健康的问题日益凸显。其中，以抗生素类和抑菌剂类药物的滥用现象最为突出^[5]。目前我国已建立相应的检测标准54个，多以药物分类、基质分类检测为主^[6]。面对琳琅满目的兽药化合物以及种类繁多的动物源性食品，以药物、基质分类进行检测的方法已不能满足批量筛查的需要，因此多兽药残留检测技术的开发和应用成为食品安全领域研究的热点^[7]。

传统的兽药残留检测方法中以液相色谱、气相色谱、液相色谱质谱检测为主，但是液相色谱因杂质干扰较大，只能满足单一类别兽药残留的检测；气相色谱因检测过程中需要进行衍生化，引入外来杂质造成数据的不准确性较高^[8-9]。液相色谱质谱仪以其结果准确、抗干扰能力强等特点快速应用于动物源性食品中兽药残留的检测。样品预处理是多残留检测的热点和难点，液液萃取^[10]、固相萃取^[11]、QuEChERS^[12]、Sin-QuEChERS Nano^[13]净化技术等是兽药残留检测常见的样品预处理技术。其中，Sin-QuEChERS Nano净化技术将QuEChERS填料与多碳纳米管相结合，实现了多残留分析过程中的一步净化技术，该方法具有准确、简单、绿色等优点。

本研究拟建立动物源性食品中 27 种兽药残留液相色谱质谱快速测定方法，应用Sin-QuEChERS Nano净化技术作为预处理手段，对仪器的检测指标进行优化，对方法的基质效应、方法学指标进行评价，从而建立高效、快速、低耗能、绿色环保的检测方法。

1 实验部分

1.1 实验仪器与设备

6460A三重四极杆串联质谱仪：安捷伦公司；电子分析天平：梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；涡旋振荡器：Heidolph公司；3K30冷冻高速离心机：Sigma-Aldrich公司；移液枪（1～10 μL，10～100 μL，100～1000 μL）：Eppendorf 中国有限公司；氮吹仪：Organomation公司。

1.2 实验试剂与材料

标准品：喹诺酮类（100 mg/L）、磺胺类（100 mg/L）、氯霉素类（100 mg/L）共计27种兽药单标溶液，诺氟沙星-D5（100 mg/L）、环丙沙星-D8（100 mg/L）、恩诺沙星-D5（100 mg/L）、磺胺邻二甲氧嘧啶-D3（100 mg/L）、磺胺间二甲氧基嘧啶-D6（100 mg/L）、氯霉素-D5（100 mg/L）等6种内标单标溶液，购自上海安谱实验科技股份有限公司。

试剂：乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱纯），购自德国Merck公司；乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、无水硫酸镁、无水氯化钠，购自国药集团化学试剂有限公司；超纯水，购自屈臣氏；Sin-QuEChERS快速净化柱，购自北京绿绵有限责任公司。

1.3 标准溶液配置

混合标准溶液：准确吸取上述单个标准溶液100 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配成质量浓度为1 mg/L的混合标准储备液，置于-18℃冰箱中保存。

混合内标标准溶液：准确吸取100 μL上述内标溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配成质量浓度为1 mg/L的混合内标储备液，置于-18℃冰箱中保存。

基质匹配标准溶液：依照样品前处理方法所得基质溶液，根据需要配制不同质量浓度的基质匹配标准溶液（现用现配）。

1.4 样品预处理

精确称取均质后畜禽肉样品5.00 g（±0.01g）于50 mL具塞离心管中，依次加入混合内标溶液0.1 mL、0.01 mol/L EDTA缓冲水溶液10 mL，涡旋1 min，使畜禽肉样品分散混匀。加入10 mL甲酸乙腈溶液（V/V 1:99），超声提取震荡10 min。依次加入1 g无水氯化钠、4 g无水硫酸镁盐析剂，涡旋震荡1 min，于4℃以13000 r/min离心5 min，移取上清液置于另一50 mL离心管中，待净化。

取Sin-QuEChERS Nano净化柱，垂直塞入带有样液的50 mL具塞离心管内，缓慢下压，至上清液达5 mL。取上清液至15 mL离心管中，于40℃水浴氮吹至干；准确加入1 mL 0.1%甲酸水乙腈溶液（V/V 20:80）复溶，涡旋混合1 min，过0.22 μm的有机相滤膜于进样瓶中，待上机分析。

1.5 色谱测定条件

色谱柱：SHISEIDO C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm），柱温：30℃；流速：0.300 mL/min；进样量：5 μL；流动相：A为0.1%甲酸水，B为乙腈；液相洗脱程序见表1。

表1 超高效液相色谱梯度洗脱程序

Table 1 UPLC gradient elution program

1.6 质谱测定条件

离子源：ESI源；采集模式：正、负离子切换模式；扫描方式：多反应监测（MRM）；毛细管：导电毛细管；毛细管电压：3500 kV；脱溶剂温度：300℃；脱溶剂气流速：12 L/min；鞘流气温度为 300°C；鞘流气流速 12 L/min。兽药质谱参数见表2。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

据文献报道，多兽药残留检测过程中常采用乙腈和甲酸水溶液作为液相色谱分析用流动相^[14]。甲酸通过对pH值的调节，保证目标化合物保持分子状态，在色谱分离下保证良好的峰形。除此之外，甲酸能够在质谱的ESI源离子化过程中提供所需的H⁺离子，提高目标化合物在质谱下的离子化效率。本研究通过对0.05%、0.1%、0.15%、0.2%的甲酸水溶液（V/V）作为流动相进行考察，结果表明0.1%甲酸水溶液作为流动相时，各化合物的离子化效果最佳。

本研究分析的兽药化合物主要以极性化合物为主，在流动相梯度洗脱程序的前25 min，通过乙腈比例缓慢的增加，保证极性化合物的分离。25 min后，在1 min内流动相比例快速回到仪器的初始比例，缩短检测时间、排除杂质的同时使得流动相比例快速回到初始值以平衡色谱柱，为下一个样品的采集做准备。经过流动相梯度配比使得不同种类的兽药得到充分分离。

2.2 质谱条件的选择

采用选择离子监控模式（MRM）时，需要在实验前对目标化合物的监测参数进行优化，以期获得最高的灵敏度和足够的定性离子^[15]。通过优化碰撞能量以获得响应最高的碎片离子以及符合化合物特征的典型的离子，如磺胺化合物共有 M/Z 92 和 M/Z 156 离子等。本研究以1.0 mg/L混合标准中间液为对象，采用液相色谱仪以两通代替液相色谱柱的方式在ESI+、ESI-模式下进行质谱参数的优化。选择干扰小、信噪比大的离子对作为定性或定量离子对。优化后的锥孔电压、碰撞能量、定性和定量离子对见表2。27种兽药 MRM 色谱图如图1～3所示。结果表明，本研究选出的定性离子对的离子丰度比符合欧盟2002/657准则对离子丰度比最大偏差允许值的要求，准则要求见表3。

2.3 净化方式的选择

本研究采用固相萃取法、QuEChERS法、Sin-QuEChERS Nano净化法进行净化，并对其净化效率和净化过程进行考察。结果表明：在准确度方面，当畜禽肉空白基质样品加标水平为10 µg/kg，采用固相萃取法净化时，27种化合物的平均加标回收率为60%～91%；采用QuEChERS法净化时27种化合物的平均加标回收率为68%～102%；采用Sin-QuEChERS Nano法净化时27种化合物的平均加标回收率为85%～112.5%。在操作步骤方面，相对于固相萃取法、QuEChERS法，Sin-QuEChERS Nano净化法的操作步骤最为简单，更适用于批量检测。在试剂消耗方面，QuEChERS法和Sin-QuEChERS Nano净化法的试剂消耗量较少。综上所述，当需要进行批量实验检测时，采用Sin-QuEChERS Nano净化法进行检测可以有效提高实验效率和加标回收率，节省操作时间。

2.4 基质效应评估

基质效应（ME）是指在样品测定过程中，由于基质中含有未净化彻底的杂质或其他化学、物理等因素影响目标化合物的离子化效果，从而影响方法的检测灵敏度^[16]。本研究在空白样品处理净化后所得空白液中添加目标化合物，在1.5所述的仪器条件下，比较空白基质标准（X）和溶剂标准（Y）的离子强度，从而评价基质效应。按照计算公式ME(%) = X/Y×100，当ME＜100%，表示该方法存在基质抑制效应；当ME＞100%，表示该方法存在基质增强效应；若ME值在80%～120%之间时，表示该方法存在基质效应较弱。通过实验表明，本研究的27种化合物的ME值在50%～75%之间，有抑制效应，因此本研究采用内标定量法消除基质效应。

3 方法学评估

3.1 标准曲线和检出限

将27种兽药残留类化合物采用已优化好的色谱条件和质谱条件进行测定，内标法定量。以27种兽药残留类化合物的质量浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表4。结果表明，在2.0～200 μg/L、0.5～20 μg/L、1.0～200 μg/L范围内目标化合物线性相关性良好，相关系数r≥0.9986。

本研究根据3倍信噪比及10倍信噪比下目标化合物色谱峰的响应值，得出动物源性食品基质中27种兽药残留类化合物的检出限分别为0.1～1.0 μg/kg、定量限分别为0.5～3.0 μg/kg，见表4。

3.2 回收率与精密度

准确称取已知空白羊肉、牛肉、猪肉、鸡肉样品各2.0 g，设定低、中、高3个添加水平（定量限1倍、5倍、10倍），采用本研究建立的方法进行检测，每组6个平行样品，测定回收率和相对标准偏差（RSD）。由表4可知，各基质中27种兽药残留类化合物的平均回收率为85.0%～112.5%，相对标准偏差为1.6%～8.2%（n = 6）。

3.3 实际样品的测定

采用本研究建立的方法和国家标准方法对检测机构经检测后的阳性样品和质控样品进行检测，样品类别包括鸡肉、牛肉、猪肉、羊肉，见表5。结果表明，通过对已知阳性样品的检测，本研究建立的方法和国家标准方法相比较，结果一致（偏差＜5%）；通过对3批质控样品的检测，本研究建立的方法和国家标准方法的检测结果符合质控样的结果偏差要求范围，说明本研究所建立的方法准确可靠。

4 结论

本研究在UPLC-MS/MS检测方法的基础上建立了基于Sin-QuEChERS Nano净化柱作为净化手段的动物源性食品中多种兽药残留的检测方法。本研究在方法学考察以及将该方法与传统方法进行对比过程中发现：采用内标添加法进行定量可消除27种兽药残留化合物的基质效应影响；方法的回收率和精密度结果良好，回收率在85.0%～112.5%范围，RSD＜10%；方法将一步净化技术与 UPLC-MS/MS结合，实现了只需一次前处理和检测即可对27种兽药进行定量检测，该方法操作简便，并可进行批量处理，从而大大节省了前处理所需的时间。

参考文献

[1]李红权, 孙良娟, 伍志强, 等. 高效液相色谱串联质谱法同时测定饲料中氯霉素、甲砜霉素与氟甲砜霉素残留[J]. 分析测试学报, 2012, 31(11): 1396-1400.

[2]薄海波, 雒丽丽, 曹彦忠, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶和奶粉中6种聚醚类抗生素残留量[J]. 分析化学, 2009, 37(8): 1161-1166.

[3]王浩, 刘艳琴, 殷晓燕, 等. 高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱法测定乳品中的氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留[J]. 中国食品学报, 2008(5): 138-141.

[4]谢丽琪, 岳振峰, 唐少冰, 等. 高效液相色谱串联质谱法测定牛奶中林可酰胺类和大环内酯类抗生素残留量的研究[J]. 分析试验室, 2008(3): 5-8.

[5]王鹏, 胡小钟, 林雁飞, 等. 高效液相色谱-串联质谱法同时测定蜂王浆中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留[J]. 分析科学学报, 2007(5): 527-531.

[6]彭涛, 李淑娟, 储晓刚, 等. 高效液相色谱/串联质谱法同时测定虾中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留量[J]. 分析化学, 2005(4): 463-466.

[7]刘敏, 曹丹, 李圣男, 等. 样品预处理与实时直接分析质谱的联用技术及应用（英文）[J]. 分析测试学报, 2021, 40(2): 171-183.

[8]付国平, 刘松雁, 张优. 超高效液相色谱-高分辨质谱在畜产品及养殖投入品中兽药残留检测中的应用[J]. 今日畜牧兽医, 2022, 38(8): 16-17+19.

[9]李潇舟, 陈海平. 高效液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素及甲硝唑[J]. 现代预防医学, 2022, 49(13): 2420-2425.

[10]柯庆青, 李诗言, 王鼎南, 等. 超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速筛查和确证渔药中86种非法添加化学品[J]. 色谱, 2022, 40(6): 520-530.

[11]杨贤丰, 王波, 张欢, 等. Sin-QuEChERS净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中8种喹诺酮类药物残留量[J]. 理化检验-化学分册, 2022, 58(3): 304-311.

[12]王艺霞, 杨琳燕, 黄迪, 等. 泡腾辅助液相微萃取/高效液相色谱法检测蜂蜜中7种喹诺酮类药物[J]. 分析测试学报, 2022, 41(3): 327-333.

[13]魏丹, 国明, 张菊. 加速溶剂萃取-磁固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中10种氟喹诺酮类药物残留[J]. 色谱, 2020, 38(12): 1413-1422.

[14]沙云菲, 谢雯燕, 王昊阳. 高分辨质谱技术研究DART离子化条件下的背景离子及潜在应用[J]. 分析测试学报, 2018, 37(10): 1264-1268.

[15]陈兴连, 李倩, 王志飞, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡肉和鸡蛋中25种兽药残留[J]. 质谱学报, 2021, 42(6): 1046-1058.

[16]金晓峰, 焦仁刚, 赵贵, 等. 通过式固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱法快速测定鸡蛋中的8种兽药残留[J]. 分析科学学报, 2020, 36(6): 906-911.

表2 33种目标化合物（含6种内标）的质谱参数

Table 2 Mass spectrometric parameters of the 33 target compounds (including six internal standards)

注: *表示定量离子

表2（续）

表3 定性确证时相对离子丰度的最大偏差

Table 3 Maximum deviation of relative ion abundance for qualitative confirmation

图1 磺胺嘧啶MRM质谱图

Fig.1 The MRM mass spectrum of Suladiazine

图2 诺氟沙星MRM质谱图

Fig.2 The MRM mass spectrum of Norfloxacin

图3 氯霉素MRM质谱图

Fig.3 The MRM mass spectrum of Chloramphenicol

表4 27种化合物的线性范围、检出限、定量限、回收率、精密度、加标回收率

Table 4 Linear range, detection limit, quantification limit, recovery rate, and precision and calibration recovery rate of the 27 compounds

注: *表示含量为0.5 μg/kg、2.5 μg/kg、5 μg/kg

表4（续）

表5 实际样品检测数据表

Table 5 Test data of actual sample