李家侨 谢艳辉 张娜 郑枢 廖金湾 郑晓聪 刘荭 尹伟力

Abstract The abundance of Environmental DNA (eDNA) is often low and not easy to detect. In order to strengthen the surveillance of Vibrio Parahaemolyticus (Vp_AHPND) in cultured seawater and give early warning of the disease, it is necessary to enrich Vp_AHPND in large volumes of water. The membrane filtration method was used to concentrate the water body to explore the effects of different volumes of aquaculture seawater, different materials and pore sizes of filter membranes, and different nucleic acid extraction kits upon Vp_AHPND in concentrated water. 500 mL of cultured seawater was collected, the water body enriched with 0.45 μm nitrocellulose membrane, and the membrane nucleic acid was extracted by the TIANGEN marine animal tissue genome DNA extraction kit. Fluorescence quantitative PCR results showed that, the copy number of Vp_AHPND in the enriched water had been amplified by more than 1000 times. The eDNA of 17 batches of imported brood shrimp carrying water and 13 batches of farmed seawater of Litopenaeus vannamei in Zhanjiang, Guangdong were tested using the membrane filtration method. Three batches of Vp_AHPND were detected positive from the shrimp larvae field, and the eDNA detection results in the water samples were consistent with the tissue detection results in the shrimp larvae after enrichment. Therefore, the membrane filtration method based on 0.45 μm nitrocellulose membrane can efficiently enrich Vp_AHPND in water. These research results can provide a new, fast, reliable, and efficient monitoring method for Vp_AHPND disease warning, scientific monitoring, and risk assessment in environmental waters such as imported parent shrimp carrying water and farmed seawater of Litopenaeus vannamei.

Keywords Vp_AHPND; environmental DNA; enrichment; monitoring; the risk assessment

环境DNA（Environmental DNA，eDNA）是指生物通过皮肤脱落、粪便、唾液、配子和分泌物等方式向环境中分泌的游离DNA，在外来物种入侵^[1-2]、濒危物种监测^[3]方面已被广泛应用。当前越来越多研究把eDNA采样应用于水生系统疫病监测领域，成为传统监测的有效补充。Rusch等^[4]首次用eDNA方法在淡水系统中检测到大西洋鲑三代虫和其宿主大西洋鲑鱼、虹鳟鱼，表明用eDNA方法检测和监控水生环境中的病原是可行的。这与传统监测方法不同，无须杀死大量的水生动物进行调查，采集水样进行分析即可，减少了采样时间和成本，生物及生态系统干扰较低，因此是一种很有前景的疫病监测工具，可以用来补充甚至取代传统监测。

当前对虾养殖业深受白斑综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）^[5]、肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei disease，EHP）^[6]、传染性皮下和造血器官坏死病（Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus，IHHNV）^[7]、急性肝胰腺坏死病（Acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）^[8]等病害的影响，特别是急性肝胰腺坏死病，早期也叫早死综合征（EMS），是携带了编码PirA和PirB毒素基因的副溶血性弧菌引起的一种对虾细菌病^[8-10]。AHPND主要影响凡纳滨对虾和斑节对虾、中国对虾^[9-11]，幼虾放池塘35 d后死亡率可以达到100%。AHPND是世界动物卫生组织（World organization for animal health，OIE）列出的肠道疫病，自2009年在中国首次报道以后^[12]，已经成为制约对虾养殖的主要病害之一。该病给中国、越南、马来西亚、泰国、墨西哥、菲律宾等国家的对虾养殖业造成了重大的经济损失^[9,13-16]。湛江是“中国对虾之都”，2019—2021年连续3年都有约20万尾的亲虾从泰国和美国进口，货值约6000万元。当前，对于对虾AHPND的监测是取虾体肝胰腺组织，先通过细菌初步富集后再进行疫病检测，耗时长，并且需要对对虾本体进行取样，而且进口亲虾价值高昂，每尾对虾约300元，对企业而言对亲虾本体直接检测成本很高。当前研究表明，环境水中病原体动态变化与疫病流行高度相关^[4]，因此本试验希望把eDNA采样引入到对虾AHPND监测中，突破传统的采样方法，而且能有效降低采样成本。

但是环境水中病原体eDNA的丰度较低，不容易被检测到，因此需要建立高效的富集方法去检测环境水中的Vp_AHPND。本研究通过结合荧光定量PCR，比对不同材质和不同孔径的滤膜浓缩Vp_AHPND效果，同时对进口清虾携带水、粤西地区养殖海水进行监测，以期为海关、水产推广站等监管部门对进出口清虾携带水、养殖场养殖海水等进行AHPND预警、监测和疫病防控提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2.7 μm GF/D膜，whatman；0.45 μm玻璃纤维膜，whatman；0.2/0.4/0.8 μm聚碳酸酯膜（PC膜），whatman；0.45 μm硝酸纤维素膜（NC膜），北京优尼康生物科技有限公司；海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（DP324），天根生化科技（北京）有限公司；DNeasy Blood & Tissue Kit（69504），Qiagen；动物源性植物饲料基因组DNA提取试剂盒（DP323），天根生化科技（北京）有限公司；Premix EX Taq^TM（RR39LR），宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 仪器与设备

Step one plus荧光定量PCR仪，美国赛默飞世尔公司；QuantStudio 5荧光定量PCR仪，美国赛默飞世尔公司；隔膜真空泵，天津津腾实验设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 Vp_AHPND菌液制备

实验室-20℃保存的Vp_AHPND菌株接种于TCBS培养基中，37℃培养16～18 h，挑取蓝绿色的单菌落，接种于200 mL 3% NaCl TSB培养基的锥形瓶中，在36℃、120 r/min条件下，振荡过夜培养。然后取1 mL菌液在12000 r/min离心2 min，留菌泥，加500 μL PBS混匀后，待核酸提取后，用于Vp_AHPND鉴定。

1.3.2 养殖海水的制备

取6尾健康的凡纳滨对虾在高浓度的菌液（将300 mL浓度为1.8×10⁸ CFU/mL 副溶血性弧菌的菌液加入到3 L的海水）中浸泡15 min，接着在低浓度的菌液（将20 mL浓度为1.8×10⁶ CFU/mL副溶血性弧菌的菌液加入到20 L的海水）中浸泡24 h，24 h后再换水，每天换水约1/2。连续培养5 d后，取养殖海水，静置后去掉粗杂质后备用。

1.3.3 滤膜材质和孔径的筛选

依次取500 mL按1.3.2所述制备的养殖海水，用0.2 μm/0.4 μm/0.8 μm孔径的聚碳酸酯膜、0.45 μm孔径硝酸纤维素膜、0.45 μm孔径玻璃纤维膜在隔膜真空泵加压的作用下过滤，滤膜干燥后取出，放入2 mL无菌离心管，用无菌手术剪刀剪成细末状，-20℃保存。同时收集未经处理的养殖海水200 μL，滤膜和养殖海水均采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取核酸。

1.3.4 不同体积养殖水Vp_AHPND浓缩效果比对

为了确定取样体积，取250 mL和500 mL两种体积养殖海水，分别用0.45 μm孔径的硝酸纤维素膜过滤在隔膜真空泵加压的作用下过滤，收集滤膜后采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取核酸。

1.3.5 核酸提取方法效果的比对

为了优化核酸提取方法，用0.45 μm孔径的硝酸纤维素膜过滤500 mL养殖海水后，滤膜分别采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒、动物源性植物饲料DNA提取试剂盒、DNeasy Blood & Tissue Kit这3种商品化的试剂盒提取核酸。因为滤膜的体积比较大，海洋动物组织基因DNA抽提试剂盒中的GA缓冲液和蛋白酶K含量加倍，分别添加400 μL、40 μL，没过滤膜，56℃水浴5 h。GB缓冲液加倍到400 μL，70℃水浴10 min，然后加入400 μL无水乙醇。剩下的程序按照说明书操作。类似的，DNeasy Blood & Tissue Kit核酸提取试剂盒中Buffer AL缓冲液和蛋白酶K含量也加倍，分别添加360 μL和40 μL，没过滤膜，56℃水浴5 h。Buffer ATL缓冲液加倍到400 μL，70℃水浴10 min，然后加入400 μL无水乙醇。剩下的程序按照说明书操作。动物源性植物饲料DNA提取试剂盒操作步骤与说明书一致。这3种核酸提取方法最后都用200 μL洗脱缓冲液洗脱DNA。

1.3.6 Vp_AHPND的荧光定量PCR检测

采用Han等^[8]的研究中VpPirA荧光定量PCR方法，合成质粒后，用双蒸水倍比稀释后，建立标准曲线，定量检测养殖海水、滤膜中Vp_AHPND的拷贝数。VpPirA的基因的引物如下， F：TTGGACTGTCGAACCAAACG；R：GCACCCCATTGGTATTGAATG；探针：FAM-AGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGG A-TAMRA。荧光定量PCR体系：Premix Ex Taq（2X）（ Probe qPCR）10 μL；F/R引物各0.4 μL，探针0.8 μL，灭菌水6.4 μL，模板2 μL，共20 μL。荧光定量PCR程序：95℃ 20 s；95℃ 3 s，60℃ 30 s，共45个循环。

1.3.7 临床样品 Vp_AHPND监测

对2022年美国和泰国进口亲虾17批样品和广东湛江地区虾苗13批样品开展AHPND监测。共采用3种方法进行检测，方法1：采用水体滤膜法，每批样品均采集500 mL养殖水先静止后去掉粗杂质，再用0.45 μm孔径的硝酸纤维素膜过滤富集后检测；方法2：虾体组织法，取亲虾的肝胰腺和虾苗组织经TSB增菌后检测；方法3：取未经处理的200 μL养殖水直接检测。上述3种方法除了样品处理方式不一样，后续核酸提取、荧光定量PCR检测程序均保持一致。

2 结果与分析

2.1 VpPirA标准曲线的建立

为了对水体中Vp_AHPND实现定量检测，把合成的VpPirA质粒梯度稀释后，浓度从10⁸拷贝/μL到10⁴拷贝/μL建立标准曲线（图1），表明建立标准曲线Ct值与模板浓度的对数呈现良好的线性关系（R² = 0.998）。

2.2 感染Vp_AHPND养殖海水的制备

保存的Vp_AHPND通过3% NaCl TSB复苏后，Vp_AHPND细菌悬液通过荧光定量PCR检测，确定为Vp_AHPND阳性（图2）。Vp_AHPND细菌悬液被用于凡纳滨对虾的浸染试验，每天换水约1/2，对虾养殖期间的海水用于后续的Vp_AHPND富集试验。

2.3 不同材质不同孔径滤膜对Vp_AHPND富集效果影响

为探究不同孔径过滤膜对环境水中Vp_AHPND富集效果的影响，分别取2.2节所述500 mL养殖海水，在隔膜真空泵的作用下，采用了0.2 μm、0.4 μm、0.8 μm孔径的聚碳酸酯膜过滤，最后收集滤膜，经核酸提取后，采用荧光定量PCR检测Vp_AHPND浓度。经过不同孔径的聚碳酸酯膜浓缩养殖海水中Vp_AHPND荧光定量PCR扩增结果，如图3所示，富集效果见表1。0.4 μm孔径的聚碳酸酯膜的富集效果最好，经富集后Vp_AHPND浓度放大了157倍，富集效果最差的是0.8 μm孔径的聚碳酸酯膜。AHPND是由一种携带了pirAB毒素基因的副溶血性弧菌引起的，Vp_AHPND约0.7～1.0 μm，因此，过大孔径的滤膜截留细菌的效果更差。

在确定0.4 μm孔径的富集效果较好后，进一步探究不同材质的过滤膜对Vp_AHPND浓缩效果的影响，采用了0.45 μm孔径玻璃纤维膜、0.45 μm孔径硝酸纤维素膜以及0.4 μm孔径聚碳酸酯膜过滤养殖海水，不同材质滤膜富集养殖海水中Vp_AHPND荧光定量PCR扩增结果如图4所示，富集效果见表1。结果表明，3种材质的滤膜浓缩效果差异很大，0.45 μm孔径硝酸纤维素膜的富集效果最好，与未经浓缩的养殖海水相比，Vp_AHPND浓度放大了1050倍。富集效果最差的是玻璃纤维素膜，与未经浓缩的养殖海水相比，Vp_AHPND浓缩仅放大了10倍，这可能是因为玻璃纤维膜很厚，吸水性很强，在核酸抽提过程消化这一步，存在一部分核酸残留在滤膜中。

表1 不同材质不同孔径滤膜Vp_AHPND富集效果

Table 1 Concentration effects of Vp_AHPND filter membranes with different materials and pore sizes

备注: 放大倍数＝(滤膜的Vp_AHPND浓度－200 μL海水的Vp_AHPND浓度）/ 200 μL海水的Vp_AHPND浓度

1: 200 μL未经处理海水; 2: 0.45 μm硝酸纤维素膜; 3: 0.4 μm聚碳酸酯膜; 4: 0.45 μm玻璃纤维膜; P: 感染Vp_AHPND组织作为阳性对照; N: 不感染Vp_AHPND组织作为阴性对照；K：灭菌双蒸水作为空白对照

图4 不同材质滤膜富集养殖海水中Vp_AHPND 荧光定量PCR扩增结果

Fig.4 Results of Vp_AHPND fluorescence quantitative PCR amplification in seawater enriched by different filter materials

2.4 不同养殖水容量Vp_AHPND富集效果影响

为了确定养殖海水的选取容量，分别收集了250 mL和500 mL两种规格养殖海水，用0.45 μm孔径的硝酸纤维素膜在隔膜真空泵作用下富集Vp_AHPND，不同体积养殖海水富集Vp_AHPND荧光定量PCR扩增结果如图5所示，富集效果见表2。结果表明2种规格体积的水体富集的效果差异不大，经富集后Vp_AHPND浓度都被放大超过了1000倍。实际上，在水体富集中发现，选取250～500 mL容量的海水会容易过滤，超过1000 mL海水很容易造成滤膜堵塞。

1: 200 μL未经处理海水; 2: 250 mL海水; 3: 500 mL海水; P: 感染Vp_AHPND组织作为阳性对照; N: 不感染Vp_AHPND组织作为阴性对照; K: 灭菌双蒸水作为空白对照

图5 不同体积海水富集Vp_AHPND荧光定量PCR扩增结果

Fig.5 Results of Vp_AHPND fluorescence quantitative PCR amplification in seawater enriched with different volumes

表2 不同体积养殖海水富集Vp_AHPND效果

Table 2 Enrichment effect of Vp_AHPND in cultured seawater of different volumes

2.5 不同核酸提取方法Vp_AHPND富集效果影响

500 mL养殖海水经0.45 μm硝酸纤维素膜富集后，分别采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒、动物源性植物饲料DNA提取试剂盒、DNeasy Blood & Tissue Kit，这3种商品化的核酸提取试剂盒提取核酸，采用不同核酸提取试剂盒Vp_AHPND扩增结果如图6所示，富集效果见表3。与未经处理的200 μL养殖水相比，用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取效果最好，浓缩倍数超过1000倍，其次是DNeasy Blood & Tissue Kit，浓缩倍数是438倍，最差的是动物源性植物饲料DNA提取试剂盒，只有114倍。

1: 200 μL养殖海水; 2: 海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒; 3: DNeasy Blood & Tissue Kit; 4: 动物源性植物饲料DNA提取试剂盒; P: 感染VpAHPND组织作为阳性对照; N: 不感染VpAHPND组织作为阴性对照; K: 灭菌双蒸水作为空白对照

图6 采用不同核酸提取试剂盒Vp_AHPND荧光定量扩增结果

Fig.6 Results of Vp_AHPND fluorescence quantitative PCR amplification with different nucleic acid extraction kits

2.6 临床样本检测

为了对进口亲虾和广东虾苗开展Vp_AHPND流行调查，分别采集30份对虾体组织、养殖水进行检测，养殖水采用两种方法：一种方法是直接取200 μL养殖水开展检测；另外一种方法是取500 mL养殖水经0.45 μm硝酸纤维膜富集后再检测。临床样品Vp_AHPND检测结果见表4，17批进口亲虾和养殖水Vp_AHPND皆为阴性，但是从广东湛江12批虾苗组织中检出Vp_AHPND阳性3批，而且其相应水过滤样本eDNA中也均为阳性，但是未经处理的养殖水只能检出一批Vp_AHPND阳性。研究表明，经富集后养殖水和对虾本体检测结果一致，养殖海水经富集后能有效反映出对虾养殖场Vp_AHPND的感染情况。

3 讨论

AHPND是当前国内对对虾养殖影响最严重的致病之一，给对虾养殖业造成了严重的经济损失。在河北、天津、山东、江苏、浙江、广西等地都分离到致病株，而且致病株出现了一定的耐药性^[17]。2017—2018年，孙卫芳等^[18]对广东茂名、汕尾两地收集的凡纳滨对虾幼虾样品中，Vp_AHPND的携带率分别是2.38%、4.76%，土塘、工厂化池塘Vp_AHPND感染率分别是4.76%、4.69%，而且虾苗、池塘水、水源水、丰年虫也检出Vp_AHPND阳性。

陈晓玲等^[19]研究发现，日照对虾试验站的中国明虾七八月份的Vp_AHPND检出率分别为15.6%和25%，同时该时期的水体中弧菌的数量呈上升趋势，说明水体中Vp_AHPND的数量变化能有效预警对虾Vp_AHPNDD感染状态。在疫病初发阶段，对虾还没有出现临床症状，养殖水中的病原体的载量较低，达不到检测限，这成为了疾病早期监测的一个瓶颈，目前国内外还未见关于对养殖海水中Vp_AHPND富集的相关研究报道。

王大勇等^[20]直接用超滤法将水体中的细菌浓缩到滤杯中，然后切膜提取核酸，无须对水体进行增菌培养，快速完成了水体富集，结合基因芯片方法，最终水体中的肠炎沙门氏菌较原来提高了100倍。一般核酸提取试剂盒是取50～200 μL样本进行核酸提取，样品量小，而水体中病原eDNA的载量低，大体积的水体需经富集后才能达到检测限。AHPND是一种携带了pirAB毒素基因的弧菌，大小约0.7～1.0 μm，病原体较大，本研究采用滤膜法富集水体的eDNA。但是市面上滤膜的材质和孔径很多，本研究比对不同孔径、不同材质的滤膜的富集效果，发现不同材质的滤膜富集效果差异较大，最终筛选出0.45 μm硝酸纤维素膜，与未经处理的200 μL海水相比，500 mL水体经富集后Vp_AHPND浓度放大了1000倍以上。这对于水体中直接检测eDNA浓度若未达到检测限，可通过滤膜法水体富集后能大大提高检测效率。目前实验室中对虾AHPND常规检测，一般是采集对虾组织进行增菌，增菌时间约6～8 h，再进行下游检测。但是水体富集在隔膜真空泵压力下，约耗时10 min就可以快速完成水体中病原体eDNA的富集。在当前进出口快速通关的背景下，充分体现了水体富集法的优越性。

核酸提取是分子检测中重要的一个环节。核酸提取方法分为手工提取和全自动提取，且都有商业化的试剂盒。全自动提取是与仪器相结合，使得提取过程更加快速、简便，手动提取在实验室应用较为广泛的是磁珠法、滤柱法^[21]。目前市面上没有专门用于滤膜样品的核酸提取方法，滤膜需要充分消化，因此采用滤柱法进行核酸提取。考虑到滤膜需要充分消化，因此使用滤柱法进行核酸提取。采用0.45 μm孔径的硝酸纤维素膜富集养殖海水，比对3种核酸提取试剂盒的提取效果差异，发现天根的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒核酸提取效果最好，浓缩效果可以放大1024倍，动物源性植物饲料DNA提取试剂盒效果最差，浓缩效果放大114倍，提示滤柱法核酸提取试剂盒核酸提取差异较大，前提是选取合适的提取方法。

本研究对进口亲虾携带水和广东湛江虾苗养殖水的30批临床样品检测中，取200 μL养殖水经核酸提取后，仅能检出1批Vp_AHPND阳性，但是取500 mL养殖水经滤膜浓缩后，检出了3批Vp_AHPNDD阳性，与组织取样法的检测结果一致，证实水体经富集后能大大提高Vp_AHPND的检出率，凸显了水体富集的重要性。研究结果也说明了eDNA采样能有效监测水体中的细菌病，eDNA的检测可以引入到水生动物疫病的监测中。但是对虾疫病除了AHPND这种细菌病，还有白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病（IHHNV）等病毒病、肝肠胞虫（EHP）等寄生虫病，需要更多的研究证实这些高发疫病对eDNA检测的适用性。

虽然这次临床样品检测中，来自于美国和泰国的亲虾均无AHPND感染，但是张娜等^[22]2016年从进境的亲虾中检出过一批AHPND阳性，因此进口亲虾的疫病传播风险不容忽视。虾苗的质量参差不齐，许昊川等^[23]在宁波多个县区中发现虾苗存在被WSSV、AHPND、十足目虹彩病毒1型( Decapod iridescent virus 1，DIV1)不同程度的感染情况。而且本研究证实了广东湛江的虾苗存在Vp_AHPND感染，这给当地的对虾养殖企业敲响了警钟，湛江作为“中国对虾之都”，培养的虾苗销往全国各地。如果携带Vp_AHPND的虾苗进入到全国各地养殖场，将严重影响养殖经济效益，因此养殖企业在放苗前，应该加强疫病监测，确保虾苗无Vp_AHPND感染。

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上: 扩增曲线; 下: 标准曲线（质粒浓度: 从10⁸ 拷贝/μL梯度稀释到10⁴拷贝/μL）, 标准曲线R² = 0.998

图1 Vp_AHPND荧光定量PCR的扩增曲线和标准曲线

Fig.1 Fluorescence quantitative PCR amplification curve and standard curve of Vp_AHPND

S:样品; P:感染Vp_AHPND组织作为阳性对照; N:不感染Vp_AHPND组织作为阴性对照; K: 灭菌双蒸水作为空白对照

图2 Vp_AHPND 荧光定量PCR扩增结果

Fig.2 Results of fluorescence quantitative PCR

amplification of Vp_AHPND

1: 200 μL未经处理海水; 2: 0.2 μm聚碳酸酯膜; 3: 0.4 μm聚碳酸酯膜; 4: 0.8 μm聚碳酸酯膜; P:感染Vp_AHPND组织作为阳性对照; N:不感染Vp_AHPND组织作为阴性对照；K:灭菌双蒸水作为空白对照

图3 不同孔径的聚碳酸酯膜富集海水中Vp_AHPND荧光定量PCR扩增结果

Fig.3 Results of Vp_AHPND fluorescence quantitative PCR amplification in seawater enriched by polycarbonate membranes with different pore sizes

表3 不同核酸提取试剂盒富集Vp_AHPND效果

Table 3 Enrichment effects of different nucleic acid extraction kits on Vp_AHPND

表4 临床样品Vp_AHPND的检测结果

Table 4 Test results of Vp_AHPND clinical samples

注: “—”表示阴性