李林杰 相湛昌 高瑞刚 王凯 刘培海

燕麦属（Avena L.）是由瑞典植物分类学家林奈建立的，约有29 种，分布在亚洲、欧洲、大洋洲、美洲的温带和寒带地区，中国有4 种，分布在华北、西北、西南高海拔地区^[1]，其中最常见的为野燕麦（A. fatua L.）、燕麦（A. sativa L.），常混于麦田中。该属的细茎野燕麦（A. barbata Brot.）、不实野燕麦（A. sterilis L.）、法国野燕麦（A. ludoviciana Dur.）是我国禁止输入的检疫性杂草，主要侵害麦类、豆类、玉米、亚麻、牧草等旱地作物，对我国的农业生产造成极大的危害和损失。随着国际贸易往来日益频繁，大豆进口量大幅度增加，燕麦属杂草种子的传入风险加大，但针对燕麦属杂草种子的鉴定却缺乏系统研究。本研究以鉴定燕麦属杂草种子为参考，构建进口大豆中杂草种子快速鉴定的技术体系，旨在为口岸杂草种子快速检疫鉴定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

在日常口岸截获中收集到的燕麦属杂草种子有6个品种18个样品（表1），对所有样品进行准确的形态特征鉴定。

表1 燕麦属杂草种子样品收集情况

Table 1 Sample collection of Avena L.

1.2 方法

口岸进口大豆的植物检疫是以截获杂草种子作为检疫重点。我国杂草种子的鉴定主要有形态特征鉴定、种植萌发鉴定、微形态特征鉴定、细胞学鉴定以及分子生物学鉴定等方法。为构建快速稳定的杂草种子鉴定体系，本研究重点以形态特征鉴定与分子生物学鉴定相结合的方式进行探讨。

1.2.1 基于形态特征探讨杂草种子的分类鉴定方法

形态特征鉴定是鉴定者通过对各类杂草种子初步识别，利用形态特征检索查出杂草种子名称，再对照每种描述和图片或者杂草种子标本进行比较、核对^[2]，鉴定快速，结果准确。形态特征鉴定法简单易行，稳定性好，虽然其他方法在鉴定结果上比较准确，但是耗时耗力，所以在口岸截获鉴定中形态特征鉴定法是最重要的鉴定方法之一。

1.2.2 基于DNA条形码鉴定探讨杂草种子的分类鉴定方法

DNA条形码技术是利用基因组中一段公认标准、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的分子诊断新技术，是传统形态鉴别方法的辅助手段和有效补充，可以实现对生物物种的准确、快速鉴别^[3]。本研究以燕麦属杂草种子为例，探究DNA条形码技术的分类鉴定方法，以期补充构建杂草种子的快速鉴定体系。

PCR引物的筛选：选取近年来重点推荐的5对序列，如ITS、matK、ITS2、rbcL、psbA-trnH 5种通用引物^[4-6]，比较其对燕麦属杂草种子的鉴别能力，考察各候选序列作为杂草DNA条形码通用引物序列的适用性，期望从参试引物中找到合适的特征性引物作为燕麦属的DNA条形码引物，为DNA条形码技术在杂草种子鉴定中的应用提供依据（表2）。

DNA提取：可以采用改良的CTAB提取的方法^[7]，或者采用试剂盒提取的方法，本研究采用天根新型植物基因组DNA提取试剂盒提取。

PCR反应体系及条件见表3、表4。

扩增完成后所得PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，产生的条带明亮、单一、大小与预期相同的可以直接送去测序，对于条带模糊的，通过调整温度等条件再进行扩增电泳，或者直接重新提取DNA，直到可以扩增出单一清晰的条带，5种引物均产生清晰的扩增条带，然后所有扩增产物由生物公司进行纯化和测序。

2 结果与分析

2.1 燕麦属杂草种子形态特征的分类鉴定结果分析

通过对燕麦属杂草种子形态、颖果形状、颜色、胚、种脐等特征进行分析，对这6种杂草种子进行形态特征的研究。从外稃的毛、芒、小穗含小花的数量、小穗脱落方式、颖片长、颖片脉数、外稃长、内稃、芒长、芒着生部位、颖果形状、颜色、胚、种脐等可以明显区别于其近似种，口岸检疫和疫情调查时，应仔细加以区别，才能有效地禁止检疫性有害生物传入，充分发挥口岸检疫的作用。

通过对监测采集的杂草标本和截获的杂草种子进行形态特征鉴定，对6种燕麦属种子进行比较，结合资料描述燕麦属外部形态特征^[8]，形成燕麦属杂草种子形态特征检索。

燕麦属杂草种子形态特征检索

1. 具小穗、小花、外稃、内稃、颖片，小穗轴间节被毛或光滑，颖片具7～11脉，颖果近似椭圆形……

……………………………………………………… 2

2. 小穗含1～2朵小花……………………………… 3

2. 小穗含2朵或2朵以上小花……………………… 4

3. 通常外稃无毛、无芒，基盘具少数毛或无毛……

……………………………………… 燕麦A. sativa L.

4. 外稃有毛、有芒，芒长在30 mm以下………… 6

5. 芒长在30 mm以上……………………………… 7

6. 外稃背面于中部以上伸出扭转膝曲的长芒，颖果呈长椭圆形，米黄色，顶端具白色毛茸，下部疏生白色柔毛，腹面具深色………………………………

………………………………… 毛燕麦A. strigosa L.

6. 外稃背面中部稍下方伸出长芒，内稃与外稃近等长，颖果狭长椭圆形，淡棕色柔毛，腹面具沟………………………………… 野燕麦A. fatua L.

6. 外稃背面中部伸出扭转膝曲的长芒，内稃比外稃短2～4 mm，颖果呈矩圆形，淡黄色，密生黄色或白色柔毛，腹面具沟…………………………………

………………………… 细茎野燕麦A. barbata Brot.

7. 颖片长25～30 mm，颖果呈狭长椭圆形，呈浅黄色或淡褐色，表面被柔毛，腹面扁平具沟，种脐不明显，淡褐色至褐色…………………………………

……………………… 法国野燕麦A. ludoviciana Dur.

7. 颖片长30～50 mm，颖果呈矩状椭圆形，米黄色至黄褐色，密被白色长柔毛，背面凸圆，腹面平，中央具一条较浅的纵沟，种脐凹入，具小尖头，黄褐色…………………………不实野燕麦A. sterilis L.

根据燕麦属杂草种子形状、大小、颜色、小穗脱落方式、小穗的小花数、颖片长、颖片脉数、外稃长、内稃、芒长、芒着生部、颖果形状、颖果颜色、胚、种脐等特点进行比较，见表5。

2.2 燕麦属杂草种子DNA条形码鉴定结果分析

利用DNAMAN8、Clustal W、MEGA 7.0等软件对所测得序列进行比较分析。根据所测各基因序列，应用MEGA 7.0软件构建单基因序列的Neigh- bor Joining（NJ）系统发育树。根据燕麦属杂草种子核苷酸序列建立的系统发育树（图1）可以看出psbA-trnH引物序列的分类能力较好，而其他4种引物序列的分类能力较差。

根据系统发育树可以看出不实野燕麦与细茎野燕麦亲缘关系比较近，毛燕麦在3个不同国家间相似系数最高，燕麦在不同国家的遗传距离远近不同，野燕麦在巴西和阿根廷比美国的相似系数高，表明地理因素与遗传距离相关。

从序列结构（图2）可以看出，利用psbA-trnH引物参试燕麦属杂草种子DNA序列大部分区域相对保守，个别区段变异明显，长度约为663 bp，各燕麦属杂草种子间最多有20处碱基差异。将引物合成的序列在Genbank上与已有的各燕麦属杂草种子的序列进行BlAST分析比较，近似程度均在98%以上。其中，不实野燕麦、细茎野燕麦与其他野燕麦在结构上碱基差异较大；毛燕麦、法国野燕麦间结构上碱基差异较小，但法国野燕麦也有个别差异，可能是由于各法国野燕麦来源地不同所致。

燕麦属样品中序列表现出明显的差异，燕麦、野燕麦、毛燕麦、法国野燕麦、不实野燕麦、细茎野燕麦等可以较好地区分出来。各燕麦属植物的亲缘关系远近可以通过系统发育树表现出来，亲缘关系越远，系统发育树上遗传距离就越远，差异就越大。通过DNA条形码选择的引物是要求DNA条形码序列存在变异，以便区分物种所用引物对燕麦属植物具有较好的特异性，psbA-trnH候选引物序列可用于燕麦属6种杂草种子DNA条形码鉴别测定。

在日常鉴定工作中，未知杂草种子可以选择通用的引物构建DNA条形码，经过BLAST分析比对，通过构建系统发育树鉴定未知杂草种子。将未知杂草种子的条形码序列与Genbank中的序列进行比对，如果在数据库中能找到完全一样的序列，则该未知杂草种子就是数据库中所对列的种类；如果未知杂草种子在Genbank中找不到对应的种，则需要参考比对相似度最大的序列，再通过结合形态特征鉴定就可以鉴定出未知杂草种子的种类^[9-11]。或者采用Clustal等软件进行多序列比对，然后计算种间和种内的遗传距离，构建系统发育树，根据未知杂草种子与Genbank中杂草种子的种类聚类情况，结合形态特征鉴定来鉴定杂草种子的种类。

3 结论

在进口大豆中杂草种子检疫鉴定中，杂草种子外部形态特征是口岸杂草种子检疫鉴定的主要依据。但在实际鉴定时，由于同属的杂草种子外部形态特征非常相似，而检疫的重要性却不同，又常混杂于进口大豆中，同时由于收获、储运、装卸等原因，外部特征往往因被磨损挤压、折断分离而损坏，且因受环境、气候、栽培条件的影响，引起形态的差别，产生个体差异，给以杂草种子鉴定为主的口岸检疫带来困难。随着分子生物学技术的迅速发展与成熟，利用分子生物学技术对杂草种子及其同属近似种进行鉴别显得尤为必要，而DNA条形码技术已经在中药材的鉴定领域应用已久^[12-14]，可以参考用来鉴定进口大豆中截获的杂草种子的类别。

燕麦属杂草种子样品保存完整的情况下，通过外稃的毛、芒、小穗含小花的数量、小穗脱落方式、颖片长、颖片脉数、外稃长、内稃、芒长、芒着生部位、颖果形状、颜色、胚、种脐等形态特征形成检索，有利于燕麦属杂草种子的快速鉴定。当外部形态特征不够明显时，通过对ITS、matK、ITS2、rbcL、psbA-trnH5种通用引物扩增的燕麦属杂草种子的DNA条形码比较分析，发现通过psbA-trnH的扩增序列种间具有足够的变异以区分不同燕麦属杂草种子，种内变异小，相对保守^[15-16]，存在高度保守区域，并且包含足够的系统进化信息可以定位样本在分类系统中的位置，种间遗传距离明显大于其他引物序列，分类效果最好，所以通过psbA-trnH引物就可以将6种燕麦属杂草种子区分。

由于DNA条形码技术具有鉴定所需样本量少，不受个体形态特征及发育阶段的影响，具有数字化的数据库，能形成统一鉴定标准并且鉴定结果准确，具有可重复性，还可以促进发现新种等优点。在日常鉴定工作中，可以选择未知杂草种子通用的引物构建DNA条形码序列，经过BLAST分析比对，通过构建系统发育树进行鉴定，并为杂草种子的新物种发现提供科学依据。

参考文献

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第一作者：李林杰（1987—），男，汉族，山东烟台人，硕士，农艺师，主要从事植物检疫工作，E-mail: 18206331636@126.com

通信作者：刘培海（1980—），男，汉族，山东聊城人，硕士，高级工程师，主要从事植物检疫工作，E-mail: liuph_513@sinna.com

1. 日照海关 日照 276800

2. 青岛国际旅行卫生保健中心（青岛海关口岸门诊部） 青岛 266000

1. Rizhao Customs, Rizhao 276800

2. Qingdao International Travel Healthcare Center (Qingdao Customs Port Outpatient Departments), Qingdao 266000

表2 所选引物表

Table 2 Selected primers

表3 PCR体系

Table 3 PCR system

表4 PCR反应条件

Table 4 PCR reaction conditions

表5 燕麦属主要形态特征比较

Table 5 Comparison of main morphological characteristics of Avena L.

图1 基于psbA-trnH序列构建的NJ树

Fig.1 NJ tree based on psbA-trnH sequence

图2 参试燕麦属植物DNA序列

Fig.2 DNA sequences of tested Avena L.

基金项目：珠海市社会发展领域科技计划重点项目（ZH22036201210211PWC）；拱北海关科技计划项目（2021GK011）

第一作者：黎财慧（1979—），女，汉族，海南琼海人，本科，农艺师，主要从事微生物学与分子生物学研究，E-mail: 54769709@qq.com

通信作者：冯家望（1965—），男，汉族，湖北荆州人，硕士，研究员，主要从事食品工程及食品安全研究，E-mail: 1696074@qq.com

1. 拱北海关技术中心 珠海 519015

1. Gongbei Customs Technical Center, Zhuhai 519015