黎财慧 游淑珠 王小玉 姚丽锋 丁琦 冯家望

Abstract The specific primers and probes were designed by using the fimY gene of Salmonella, and the concentration of propidium azide bromide (PMA) dye and related reaction conditions were optimized. A TaqMan real-time fluorescent PCR method for rapid detection of Salmonella in food was established by using a high brightness blue Light Emitting Diode（LED）instead of halogen light sources. The experiments showed that the primers and probe were highly specific, all of the 7 Salmonella strains could be amplified, while other 7 non-Salmonella strains were not amplified. The detection sensitivity of Salmonella in pure culture could reach 10² CFU/mL. When under the optimized pretreatment conditions, incubated in dark with 20 μmol/L of PMA for 10 min followed by 10 min of light exposure, DNA amplification of 10⁶ CFU/mL heat-killed Salmonella was effectively inhibited, and the DNA amplification of live Salmonella had not been affected. Food samples artificially mixed-contaminated with three different concentrations (5 CFU/25 g, 50 CFU/25 g, 500 CFU/25 g) of live Salmonella and high concentration (10⁶ CFU/25 g) of dead Salmonella, and food samples artificially contaminated only with high concentration of dead Salmonella were detected with TaqMan real-time PCR both combined with optimized PMA pretreatment and without PMA pretreatment. The results showed that all food samples artificially mixed-contaminated with live Salmonella and dead Salmonella were detected positive with the two methods, while food samples artificially mixed-contaminated only with dead Salmonella were detected negative in the PMA pretreatment group and positive in control group without PMA pretreatment. It proved that the optimized PMA pretreatment had avoided false positive results caused by dead Salmonella on TaqMan real-time PCR, and live Salmonella in food samples could be effectively detected. It took only 4-5 h for the detection of live Salmonella in food after enrichment, and the method was a scientific and effective method for rapid detection of live Salmonella in food.

Keywords Salmonella; live bacteria; Propidium Monoazide Bromida (PMA); TaqMan real-time PCR (TaqMan real-time polymerase chain reaction)

沙门氏菌（Salmonella）广泛分布于自然界，是一种最常见的食源性致病菌，能引起人类及动物的食物中毒及各种疾病，如伤寒、肠胃炎，严重时会引发败血症等^[1-3]。由沙门氏菌引起的食物中毒占世界各类细菌性食物中毒的首位。据报道，人类主要通过被沙门氏菌污染的肉、蛋、奶等食品及其相关产品感染沙门氏菌^[4-5]。GB 29921—2021《食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》和GB 31607—2021《食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》中普遍规定在食品中不得检出沙门氏菌^[6-7]。

目前沙门氏菌的检测技术有传统法、分子生物学检测方法等，其中分子生物学检测方法以其快速、灵敏、特异的优点被广泛应用^[3]。致病菌活菌检测技术应用最广泛、最简单的是传统培养法，通过一系列的增菌、选择性培养、生化鉴定实现活菌检测。传统的沙门氏菌检测方法从增菌培养到生化和血清鉴定，通常需要5～7 d，十分耗时且操作繁锁。沙门氏菌的快速检测方法是以普通PCR方法和实时荧光PCR方法为代表的分子生物学技术，因其弥补了沙门氏菌传统检测方法的不足而被广泛应用。TaqMan实时荧光PCR方法在普通PCR特异性引物的基础上引入TaqMan探针，使扩增的特异性进一步提高，且具有灵敏度高、重复性好、快速、高通量的特点。同时，该方法完全闭管的操作，不仅避免了开盖引起的污染问题，也减少了对环境的影响，使得TaqMan实时荧光PCR方法在致病菌快速检测领域具有独特优势^[8-9]。

传统的分子生物学技术在微生物检测中既能对活菌核酸扩增，也能对死菌核酸进行扩增，无法区别样品中的活菌和死菌，从而可能出现假阳性结果^[10-12]。叠氮溴化丙锭（Propidium Monoazide Bromida，PMA）是一种能够在光照条件下经受损细胞膜进入死菌细胞中，与死菌细胞的核酸进行反应并结合，使死菌细胞核酸无法被PCR扩增的一种荧光染料^[13-14]。近年来，随着研究的深入，PMA结合分子生物学技术已成功用于细菌和病毒检测，能消除死细胞的假阳性结果，有效实现检出食源性细菌和病毒活细胞的目的^[15-16]。

本研究以食品中沙门氏菌活菌为研究对象，设计并筛选出检测沙门氏菌特异性基因的引物和探针，通过对PMA浓度、暗反应时间、曝光时间等进行优化，确定了不影响沙门氏菌活菌DNA扩增和有效抑制沙门氏菌死菌DNA扩增的最佳条件，建立了检测食品中沙门氏菌活菌的PMA处理TaqMan实时荧光PCR方法。本研究使用高亮度蓝色发光二极管（Light Emitting Diode，LED）光源代替大功率卤素光源，并首次将我国自主生产的PMA光解设备成功应用于致病菌活菌检测，其发热少，自带散热装置，操作简便，既能保障激发PMA的最佳发射波长，又可避免受热造成的活菌死亡，为其在其他致病菌活菌检测中的应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

实验所用菌株见表1。

表1 特异性试验用菌株

Table 1 Information of bacterial strains used for specificity tests in the study

1.1.2 主要试剂和仪器

培养基：缓冲蛋白胨水（BPW）和菌落计数琼脂（PCA）购自北京陆桥生物技术有限公司。

试剂：Chelex-100（美国SIGMA）；PMA（美国Biotium公司）；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）(大连宝生物工程有限公司）；DEPC水（上海生工生物公司）。

仪器：7500 FAST Real-Time PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；PL-PMA光解仪（北京普林赛斯科技有限公司）；easyMIX拍击式均质器（法国AES公司）。

1.1.3 引物与探针

选择GenBank中沙门氏菌的fimY基因（基因序列号：M90677.1），用Primer Premier 6引物设计软件设计引物和探针。上游引物：TGAGGTCCTGACGCAACTTC，下游引物：ATATCTGCGGCGTTGGAGAG，探针：FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-BHQ1，均委托珠海睿辉公司合成。引物对和探针均用DEPC水稀释到储备浓度100 μmol/L，-20℃保存，临用前用DEPC水稀释至10 μmol/L。

1.1.4 试验样品

奶粉、鸡蛋、肉沫均从市场购得。

1.2 实验方法

1.2.1 沙门氏菌培养及其活菌和死菌菌悬液制备

将本实验室保存的沙门氏菌CCTCC AB 94018菌株的新鲜培养纯菌落物用无菌生理盐水调整菌液浓度至10⁸ CFU/mL，制得活菌菌悬液。取活菌菌悬液10 mL在水浴100℃下热致死10 min制备死菌悬液。同时，将处理后的菌悬液按照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》用PCA进行倾注平板法计数^[17]，以确定死菌悬液是否完全灭活。

将上述10⁸ CFU/mL浓度沙门氏菌活菌菌悬液和沙门氏菌死菌菌悬液分别按照GB 4789.2—2022的方法进行10倍递增梯度稀释，获得稀释度为10¹～10⁸ CFU/mL的菌悬液，同时按照GB 4789.2—2022方法用PCA进行倾注平板法计数。

1.2.2 DNA模板提取

采用10% Chelex-100提取方法：取菌悬液1 mL于灭菌离心管中，12000 r/min离心5 min，弃上清，在沉淀中加入100 μL 10% Chelex-100溶液，漩涡混匀5 s；56℃水浴 30 min，漩涡混匀5 s，100℃水浴10 min，漩涡混匀5 s；12000 r/min离心5 min，取上清液作为DNA模板。

1.2.3 TaqMan实时荧光PCR检测

RT-PCR反应体系（25 μL）：Premix Ex Taq^TM（2×）12.5 μL，正向引物1.0 μL（10 μmol/L），反向引物1.0 μL（10 μmol/L），探针1.0 μL（10 μmol/L），DEPC水7.5 μL，DNA 模板2 μL。反应条件设置为：95℃预变性3 min；94℃变性5 s，60℃退火延伸40 s，同时收集FAM荧光，进行45个循环。

1.2.4 引物、探针特异性验证

分别提取表1中本实验室保存的7株沙门氏菌标准菌株和7株非沙门氏菌标准菌株的DNA作为模板进行TaqMan实时荧光PCR检测，用以验证上述引物、探针的特异性。

1.2.5 TaqMan实时荧光PCR的灵敏度试验

取稀释度10¹ CFU/mL、10² CFU/mL、10³ CFU/mL、10⁴ CFU/mL、10⁵ CFU/mL、10⁶ CFU/mL、10⁷ CFU/mL、10⁸ CFU/mL的菌悬液各1 mL于灭菌离心管中，提取DNA后进行TaqMan实时荧光PCR检测。每组设置2个平行。

1.2.6 PMA作用条件的优化

（1）PMA工作液配制。1 mg的PMA完全溶解于1.957 mL的DEPC水中，配制成浓度为1000 μmol/L的PMA储备液，-20℃避光冷冻保存。使用前，用DEPC水稀释成所需浓度的PMA工作液。

（2）最佳PMA浓度的选择。2.5×10⁶ CFU/mL死菌菌悬液400 μL加入PMA工作液至终浓度为0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L，DEPC水补足体积至500 μL，旋涡混匀5 s，暗反应5 min，然后放入PL-PMA光解仪中曝光10 min，同浓度的活菌菌悬液相同处理作为对照组。提取DNA后进行PCR检测。每组设置2个平行。

（3）最佳暗反应时间的选择。2.5×10⁶ CFU/mL死菌菌悬液400 μL加入最佳浓度PMA，DEPC水补足体积至500 μL，混匀后于暗处分别反应2 min、5 min、10 min、15 min、20 min，然后置于光解仪中曝光10 min，活菌组与死菌组相同处理作为对照，提取DNA后进行PCR检测。每组设置2个平行。

（4）最佳曝光时间的选择。2.5×10⁶ CFU/mL死菌菌悬液400 μL加入最佳浓度PMA，DEPC水补足体积至500 μL，混匀后于最佳暗反应时间反应后，置于光解仪中，分别进行2 min、5 min、10 min、15 min、20 min曝光，活菌组与死菌组相同处理作为对照，提取DNA后进行PCR检测。每组设置2个平行。

1.2.7 人工污染样品中沙门氏菌活菌检测

称取经GB 4789.4—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》中方法^[18]确认无沙门氏菌污染的样品的奶粉、鸡蛋、肉沫样品各4份，每份25 g，分为A组、B组、C组、D组。其中，A组、B组、C组分别在奶粉、鸡蛋、肉沫3种样品中加入沙门氏菌活菌和沙门氏菌死菌，使沙门氏菌活菌浓度分别为5 CFU/25 g、50 CFU/25 g、500 CFU/25 g，死菌浓度均为5×10⁶ CFU /25 g；D组为奶粉、鸡蛋、肉沫3种样品中只加入浓度为5×10⁶ /25g沙门氏菌死菌。每组设置2个平行。

将上述人工污染样品分别加至225 mL BPW中，拍击式均质器均质2 min，于36℃增菌16 h，取1 mL培养液，12000 r/min离心5 min，弃上清液，向沉淀中加入100 μL DEPC水，振荡至沉淀完全悬浮，在上述PMA优化条件下处理，提取DNA后进行PCR检测。另设置以DEPC水代替PMA做相同处理作为对照组。

2 结果与分析

2.1 菌悬液浓度测定

将10⁸ CFU/mL浓度的沙门氏菌活菌菌悬液进行10倍递增梯度稀释，同时按照GB 4789.2—2022用PCA进行倾注平板法计数，经计算，活菌悬液浓度为2.5×10⁸ CFU/mL；死菌菌悬液平板上均无菌落长出，表明100℃水浴处理10 min可使细菌完全热致死，将以此方法制备的菌液用于后续实验。

2.2 TaqMan实时荧光PCR引物、探针特异性验证

不同实验菌株扩增结果见表2，7株沙门氏菌标准菌株和7株非沙门氏菌标准菌株的DNA作为模板进行TaqMan实时荧光PCR扩增，7株沙门氏菌标准菌株均扩增阳性，其他7株非沙门氏菌标准菌株均无扩增，表明引物、探针特异性良好。

2.3 TaqMan实时荧光PCR灵敏度验证

针对fimY基因设计的引物、探针对沙门氏菌10¹ CFU/mL、10² CFU/mL、10³ CFU/mL、10⁴ CFU/mL、10⁵ CFU/mL、10⁶ CFU/mL、10⁷ CFU/mL、10⁸ CFU/mL梯度浓度的检测结果如图1所示。由图显示，用PMA-TaqMan-RT-PCR方法检测10¹～10⁸ CFU/mL连续梯度稀释的沙门氏菌，10¹ CFU/mL未检出，其余梯度结果均出现明显扩增曲线（10⁸ CFU/mL Ct值约为19，10⁷ CFU/mL Ct值约为22，10⁶ CFU/mLCt值约为25，10⁵ CFU/mLCt值约为29，10⁴ CFU/mL Ct值约为32，10³ CFU/mL Ct值约为36，10² CFU/mL Ct值约为39），可判断该引物探针的检测灵敏度为10² CFU/mL。

图1 fimY引物、探针灵敏度检测结果

Fig.1 The sensitivity results of the primers and probe of fimY

2.4 PMA工作条件的优化

2.4.1 最佳PMA浓度优化

将2.5×10⁶ CFU/mL的活菌菌悬液和死菌菌悬液400 μL分别加入不同终浓度PMA，DEPC水补足体积至500 μL，暗反应5 min，曝光反应10 min后，TaqMan-RT-PCR扩增的Ct值如图2所示。在0～50 μmol/L的浓度范围内，随着PMA浓度的逐渐增加，活菌组的Ct值逐渐上升；0～20 μmol/L的浓度范围内，Ct值稳定在27左右，表明该浓度范围内的PMA对活菌的扩增没有影响；在30～50 μmol/L浓度范围内，Ct值稳定在31左右，说明较高浓度的PMA对活菌存在一定的抑制作用；在浓度0～50 μmol/L范围内，随着PMA浓度的逐渐增加，死菌组的Ct值较活菌上升快。浓度20～50 μmol/L，死菌的Ct值均＞36；浓度为20 μmol/L时，活菌与死菌的Ct值结果相差最大（ΔCt值＞9），说明该浓度下的PMA可以对活菌DNA扩增无影响且能有效抑制死菌DNA扩增。根据以上结果，将20 μmol/L确定为PMA的最佳工作浓度。

图2 不同浓度PMA对TaqMan实时荧光PCR的影响

Fig.2 Effects of different PMA concentrations on TaqMan real-time PCR

2.4.2 最佳暗反应时间优化

将2.5×10⁶ CFU/mL活菌菌悬液和死菌菌悬液400 μL分别加入终浓度20 μmol/L的PMA，DEPC水补足体积至500 μL，经过2 min、5 min、10 min、15 min、20 min暗反应后，分别置于光解仪中曝光10 min，TaqMan-RT-PCR扩增Ct值如图3所示。在暗反应5～20 min范围内，随着暗反应时间的增加，活菌组Ct值无显著差异，表明该暗反应时间对活菌的扩增没有影响；而在相同条件下，死菌组的Ct值呈现先升后降的趋势，暗反应5～10 min时Ct值＞36，其余3个死菌组的Ct值均＜36。暗反应5 min时活菌和死菌的Ct值相差最大（ΔCt值＞10），且PMA对死菌的抑制作用效果最好，因此，将5 min确定为最佳暗反应时间。

图3 不同暗反应对TaqMan实时荧光PCR的影响

Fig.3 Effects of different dark reaction time on TaqMan real-time PCR

2.4.3 最佳曝光时间优化

将2.5×10⁶ CFU/mL活菌菌悬液和死菌菌悬液400 μL分别加入终浓度为20 μmol/L PMA，DEPC水补足体积至500 μL，暗反应5 min处理后，置于不同的曝光反应时间进行反应后，TaqMan-RT- PCR扩增Ct值如图4所示。曝光时间在2～20 min范围内，活菌组的Ct值稳定在27左右，无显著性差异；死菌组DNA的扩增受到抑制，呈现先上升后下降的趋势，10 min时，死菌Ct值达到最大（＞36），且活菌组和死菌组的Ct值结果差异最大（ΔCt值＞9），表明在该曝光时间时，PMA对死菌的抑制作用效果最好。因此，将10 min确定为最佳曝光时间。

2.5 人工污染样品的检测

3种不同活菌浓度（5 CFU/25 g、50 CFU/25 g、500 CFU/25 g）和死菌（5×10⁶ CFU /25g）的人工混合污染样品和仅死菌（5×10⁶ CFU /25g）人工污染样品检测结果见表2。结果表明，所有添加了3种不同浓度活菌和死菌的人工混合污染的样品，经过沙门氏菌PMA处理组和对照组的检测结果均为阳性；只添加死菌的3种人工污染样品PMA处理组扩增结果均为阴性；对照组沙门氏菌检测结果均为阳性。据此，可判断优化后的PMA处理方法排除了沙门氏菌死菌DNA对TaqMan实时荧光PCR假阳性的影响，并且可有效检出食品样品中的沙门氏菌活菌。

3 讨论

PMA是一种具有高度亲和力的DNA染料，能够透过死菌的受损的细胞膜，不能透过活菌的完整细胞膜，与死菌细胞的DNA在光反应过程中共价交联，共价交联后的DNA失去溶解性，从而导致其在随后的基因组DNA提取过程中被去除。因而，由活菌和死菌组成的菌悬液经PMA处理后，在核酸提取后进行PCR扩增，即选择性扩增了活菌的DNA。细菌种类、细胞结构及实验条件的不同都会对PMA的作用产生影响，因而必须根据具体的试验对象对实验条件进行优化调整。

PMA结合传统分子生物学技术已成功应用于致病菌检测领域，能消除死细胞的假阳性，有效检出活性致病菌，不仅可以弥补致病菌活菌培养分离的传统检测方法检验周期长的缺陷，也能克服传统分子生物学技术因为死菌扩增检出假阳性的不足，应用前景广阔。

PMA的处理是光反应过程中透过死菌受损的细胞膜的PMA与死菌DNA共价交联，同时多余的游离PMA水解形成羟胺化合物而终止了其结合能力，从而保证了后续实验的可靠性，因而尤为重要。PMA光反应过程需要在强光照射条件下进行，所需的光源主要是500～750 W的大功率卤素灯，也可使用LED灯作为光源。大功率卤素灯发热量大，实验要在冰上进行，否则会导致部分活菌严重受热而死亡；高亮度蓝色LED光源发热小，其波长范围与卤素灯类似，既能保障激发PMA的最佳发射波长，又可避免受热造成的活菌死亡，是替代大功率卤素灯的理想光源。本实验所用的光解仪采用高亮度蓝色LED光源，发热小且有散热装置，同时操作简便，达到了PMA与沙门氏菌DNA的偶联反应的理想效果。

4 结论

本研究设计的引物、探针特异性强，能特异性扩增7株沙门氏菌，其他非沙门氏菌均无扩增，对沙门氏菌纯培养物检测灵敏度可达10² CFU/mL。经反应条件优化后，利用PMA结合TaqMan实时荧光PCR技术建立了食品中沙门氏菌活菌的特异性检测方法，检测结果不受沙门氏菌死菌的影响，能有效检出食品样品中的沙门氏菌活菌，可有效避免食品可能存在的沙门氏菌死菌导致的假阳性问题，食品样品增菌后的检测过程只需4～5 h，是一种特异性强、灵敏度高、快速的检测方法，为食品中沙门氏菌活菌检测提供了一种科学有效的方法，具有一定的应用前景。

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表2 引物与探针特异性试验结果

Table 2 Test results of the primes and probe specificity

注: “+”表示出现扩增, “－”表示无扩增

图4 不同曝光反应时间对 TaqMan实时荧光PCR的影响

Fig.4 Effects of different exposure time on TaqMan real-time PCR

表3 人工污染样品检测结果

Table 3 Test results of artificially contaminated samples

注: 1. 结果为进行两次平行扩增的结果; 2. “+”表示出现扩增; “－”表示无扩增

基金项目：海关总署科研项目（2019HK018，2020HK281，2020HK300，2022HK053）

第一作者：王翔（1979—），男，汉族，江苏徐州人，博士，高级工程师，主要从事信息化工作，E-mail: newonemail@163.com

通信作者：关荣（1981—），女，汉族，北京人，硕士，工程师，主要从事法检业务工作，E-mail: xueren_0002@163.com

1. 全国海关信息中心 北京 100005

2. 海关国际贸易信息标准化应用创新实验室 北京 100005

3. 北京中海通科技有限公司 北京 100023

4. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

1. The National Information Center, General Administration of Customs, Beijing 100005

2. Laboratory of International Trade IT Standards, General Administration of Customs, Beijing 100005

3. China CUSLINK Co., LTD, Beijing 100023

4. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026