刘志玲 梅明珠 吴晓薇 段燕喻 曾潇 陈茹

基金项目：广州海关科研项目（2021GZCK18）

第一作者：刘志玲（1984—），女，汉族，广东清远人，硕士，高级兽医师，主要从事进出境动物疫病检测工作，E-mail: liuzl@iqtcnet.cn

通信作者：陈茹（1968—），女，汉族，海南海口人，博士，研究员，主要从事进出境动物检疫分子生物学技术研发及应用，E-mail: chenr@iqtcnet.cn

1. 广州海关技术中心 广州 510623

1. Guangzhou Customs Technology Center, Guangzhou 510623

猪腹泻是困扰我国养猪业的重要疾病之一。引起猪腹泻的病因有多种，其中以病毒性腹泻的发生率最高、危害最严重^[1]。近年来，猪腹泻的发生率呈上升趋势，给养猪业造成巨大经济损失。猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪Delta冠状病毒（porcine delta coronavirus，PDCoV）均属于冠状病毒科冠状病毒属，是引起猪病毒性腹泻的主要病原^[2-3]，各种年龄段猪只均易感染，特别是对新生仔猪的危害最为严重。TGEV、PEDV和PDCoV 感染猪的临床症状均表现为腹泻、呕吐脱水和食欲下降等^[4]。由于这3种病原引起的临床症状及病理特征表现相似，且呈现混合感染的特点^[5]，给猪腹泻病的监测和诊断造成了困难。

液相芯片是将流式检测与芯片技术有机结合的新一代生物芯片技术，其突出的优点是仅需少量样品即可同时检测样本中的多种不同目标分子。目前该项技术在动物疫病检测领域已得到广泛应用^[6-10]。本研究利用Luminex液相芯片平台建立同步检测TGEV、PEDV和PDCoV的三重液相芯片方法，快速高效地对3种病原进行鉴别诊断，以期为临床样本检测提供高效、灵敏的检测平台。

1 材料和方法

1.1 样品来源

TGEV、PEDV和PDCoV灭活病毒液由本实验室保存，PDCoV阳性临床样品核酸由华南农业大学动物科学学院馈赠，其他临床样品核酸由本实验室保存。TGEV、PEDV和PDCoV病毒核酸等体积混合制备成模拟混合样本。

1.2 主要试剂与设备

病毒核酸提取试剂盒（货号AS1150）为Promega产品；一步法RT-PCR试剂盒（货号RR057A）、一步法荧光定量RT-PCR试剂盒（货号RR064A）均为Takara产品；磁性荧光编码微球（货号MC10013、MC10015、MC10025）、鞘液（货号40-50019）均为Luminex产品；1 mg/mL 链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE，货号S866,）为Invitrogen产品；5 mol/L 氯化四甲基胺（TMAC，货号T3411）、[2-(N-吗啡基）乙磺酸]（MES，货号M3671）均为Sigma 产品； [1-乙基-(3-二甲基-丙烷)氢氯化二酰亚胺（EDC，货号22980）为Pierce 产品；Maxwell 16全自动核酸提取仪（Promega公司生产）；MAGPIX液相芯片仪（美国Luminex公司生产）；Stepone Plus荧光定量PCR仪、Vertii96梯度PCR仪（美国ABI公司生产）。

1.3 方法

1.3.1 引物探针设计与合成

根据GenBank上公布的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪Delta冠状病毒（PDCoV）基因序列，通过生物信息学软件比对找出保守的基因区域，利用软件分别设计特异性引物和探针。在各下游引物5'端用生物素（Biotin）标记，各探针5'端C12用氨基标记。引物探针委托上海生工生物工程有限公司定制合成，序列见表1。

1.3.2 病毒核酸提取与多重RT-PCR扩增

采用Promega Maxwell 16全自动核酸提取仪，参考全病毒核酸提取试剂盒说明书对病毒样本进行核酸提取。经过对引物浓度、退火温度及模板用量的优化，建立50 µL多重RT-PCR体系，每个反应含2×one step RT-PCR buffer 25 µL，one step enzyme mix 1 µL，每种上游引物（10 µmol/L）各0.5 µL，每种生物素标记下游引物（10 µmol/L）各1 µL，核酸模板5 µL，加超纯水补足体积至50 µL。每次试验设置阴性对照。RT-PCR扩增程序为：50℃逆转录15 min；94℃预变性2 min；94℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 20 s，35个循环；72℃ 5 min。

1.3.3 氨基标记的探针与微球偶联

将TGEV、PEDV和PDCoV的特异性探针分别偶联至不同编码的荧光微球。振荡重悬微球，取50 µL相应的荧光编码微球原液（2.5×10⁶个/mL）至1.5 mL微量离心管中，12000 r/min离心5 min，弃上清。用100 μL MES（0.1 mol/L，pH 4.5）重悬微球后，依次加入3 μL相应的氨基标记探针（0.1 nmol/μL）与10 µL新鲜配制的EDC溶液(10 mg/mL)，充分混匀，在摇床慢速振动下室温反应30 min。依次用900 μL 0.02% Tween-20和0.1% SDS 洗涤偶联微球，最后用100 μL 1×TE（pH 8.0）缓冲液重悬偶联微球，避光保存于4℃备用。

1.3.4 杂交检测

用1.5×TMAC杂交液稀释偶联微球配制微球工作液，调整微球浓度至每个反应含3种编码微球各500～1000个。在0.2 μL PCR反应管加入微球工作液33 μL，加入PCR产物10 μL，再加入TE（pH 8.0）7 μL ，充分混匀。在PCR仪中运行杂交程序：94℃变性3 min，54℃孵育20 min。杂交反应结束后，12000 r/min离心5 min去上清。用1× TMAC配制SA-PE报告液（终浓度3.3 µg/mL），每管反应加入SA-PE报告液80 μL，混匀后继续54℃孵育5 min。设置MAGPIX液相芯片仪预热加热板至54℃，并在读数前添加对微球清洗的程序。最后上机读取样品的平均荧光强度（median fluorescent intensity，MFI）值。阴性样本MFI值的平均值为结果判定的本底值。根据Luminex公司技术指引文件的建议，设定判定标准：当检测时读取每种微球个数≥50且阴性对照MFI＜300时结果可信。液相芯片定性结果比值（LQRR）等于样品MFI与本底值的比值。当样品MFI≥300且LQRR≥3时则判为阳性，否则判为阴性。

1.3.5 特异性试验

利用本研究建立的三重液相芯片方法对模拟混合样本、PEDV、PDCoV、TGEV以及猪轮状病毒（PoRV）、口蹄疫病毒（FMDV）、水疱性口炎病毒（VSV）、蓝耳病病毒（PRRSV)、非洲猪瘟病毒（ASFV）等常见猪病的核酸样本进行检测，评估所建立的三重液相芯片方法的特异性。

1.3.6 灵敏度试验

分别测定PEDV、PDCoV和TGEV的起始模板核酸浓度，并进行10倍系列稀释。用建立的三重液相芯片对倍比稀释模板进行检测，评估此方法的灵敏度。

1.3.7 临床样品检测

应用本研究建立的三重液相芯片方法对52份临床样品核酸进行检测，临床样品包括6份肠内容物样本和46份粪便样本。同时采用现行行业标准或地方标准的荧光RT-PCR方法对同组临床样品进行PEDV、PDCoV和TGEV检测。其中，PEDV依据行业标准SN/T 1699—2017^[11]，PDCoV依据行业标准SN/T 5124—2019^[12]，TGEV依据浙江省地方标准DB33/T 2254—2020^[13]，以评估所建立的三重液相芯片方法与荧光RT-PCR方法检测结果的一致性。

2 结果

2.1 特异性试验

用本研究建立的三重液相芯片对模拟混合样本、PEDV、PDCoV、TGEV以及其他常见猪病的核酸样本进行检测。结果显示，模拟混合样本、TGEV、PEDV和PDCoV相应目标的MFI≥300，且LQRR＞3；而其他非特异病毒核酸PoRV、FMDV、VSV、PRRSV、ASFV和阴性对照的MFI＜300，LQRR＜3，见表2。本研究所建立的三重液相芯片方法可准确、特异地检出模拟混合样本、TGEV、PEDV和PDCoV，与其他常见猪病的病原核酸无交叉反应。

表2 三重液相芯片特异性检测试验结果

Table 2 Specificity test results of liquichip method

注: 表中加粗的数字表示阳性反应

2.2 灵敏度试验

以NanoDrop-2000 微量分光光度计测定TGEV、PEDV和PDCoV核酸的起始浓度分别为33.2 ng/μL、16.3 ng/μL和12.1 ng/μL。分别取10^-1～10^-4倍比稀释的核酸5 μL作为模板进行灵敏度试验。检测结果显示（表3），三重液相芯片对PEDV核酸可检出的最高稀释度为10^-2，即检测灵敏度为163 pg/μL；三重液相芯片对TGEV和PDCoV核酸可检出的最高稀释度为10^-3，即检测灵敏度分别为33.2 pg/μL和12.1 pg/μL。

表3 三重液相芯片灵敏度试验结果

Table 3 Sensitivity test results of liquichip method

注: 表中加粗的数字表示阳性反应

2.3 临床样品检测

用本研究建立的三重液相芯片与荧光RT-PCR方法同时对52份临床样品核酸进行了检测，结果见表4。两种方法阳性检测结果一致，TEGV的检出率为17.31%（9/52），PEDV的检出率为19.23%（10/52），PDCoV的检出率为9.62%（5/52），均为从粪便样本核酸中检出。三重液相芯片与荧光RT-PCR法检测结果符合率100%。

表4 临床样品检测结果

Table 4 Results of clinical samples

3 讨论

目前，猪腹泻相关病毒的多重检测方法已有报道，如李莎莎等^[14]建立多重RT-PCR检测方法同步检测PDCoV、 PEDV、TGEV与PoRV；李军等^[15]建立多重荧光定量RT-PCR方法同步鉴别TGEV、PEDV与PoRV；滑翔等^[16]构建cDNA基因芯片可同步检测TGEV、PEDV与PoRV。本研究建立的三重猪腹泻病毒液相芯片技术可同时检测TGEV、PEDV和PDCoV，为猪腹泻相关病毒的多重检测提供新的技术参考。该方法所建立的三重液相芯片对临床样品的检测结果与现行标准推荐的荧光RT-PCR方法具有高度的一致性，说明本研究建立的三重液相芯片方法的检测准确性高。

液相芯片的检测结果受PCR产物用量、杂交温度、SA-PE浓度等多种因素的影响^[17]。有文献报道指出不同引物比例的添加量也对检测MFI值有影响，即提高PCR反应体系中生物素标记引物的浓度可有效提高PCR产物中含生物素标记单链的产量，从而使探针与PCR产物杂交效率更高，达到检测信号放大的效果^[18]。本研究亦采用引物不对称扩增，当上下游引物比例为1∶2时，检测LQRR值最高，敏感性最好。液相芯片检测技术的结果判定没有统一的标准，需要根据所研究的目标与实际情况分析充分的数据来综合考虑。部分报道^[19-20]中研究者以一定量的阴性样品MFI的平均值加3倍标准差计算阈值，来制定判定标准。本研究参考Luminex公司技术指引文件的建议及参考文献^[9,18]中研究者的经验，制定的评判标准为样本MFI≥300，LQRR≥3判为阳性；否则，判为阴性。

Luminex液相芯片技术是新型的快速高通量检测技术。其基础是荧光编码微球，每种微球因为荧光比例不同，可被激光特异性识别。通过将氨基标记探针与荧光编码微球偶联，样本经过带有生物素标记的引物多重PCR扩增，其产物与相应探针杂交实现多重目标的同步检测，再通过生物素-链霉亲和素系统，放大杂交信号^[21]。由于设计选用了高特异性的引物探针，使液相芯片方法的特异性和敏感性高于传统的PCR检测方法^[22-23]。但也有研究表明随着液相芯片检测通量的提高，检测敏感性会出现一定程度的下降^[24]。尹伟力等^[23]与阮智杨等^[25]的研究表明，采用液相芯片方法对临床样品的检测结果与传统PCR方法符合率高。本研究建立的液相芯片方法对临床样品检测与现有方法符合率情况与同类研究一致。

4 结论

本研究应用液相芯片技术原理成功建立了同步快速准确区分TGEV、PEDV和PDCoV的三重液相芯片方法。该方法具有良好的特异性、敏感性，为3种病原进行鉴别诊断提供高效灵敏的检测平台，适用于海关口岸实验室快速鉴别诊断，具有广阔的应用前景。

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表1 引物及探针序列

Table 1 Primers and probes sequences