王娟 寇宗红 王建荟 王波 丁欢 刘阿静

基金项目：甘肃省市场监督管理局科技计划项目（SSCJG-SP-202115）

第一作者：王娟（1990—），女，汉族，甘肃定西人，本科，兽医师，主要从事色谱分析及食品安全检测工作，E-mail: 731027858@qq.com

通信作者：刘阿静（1987—），女，汉族，陕西咸阳人，硕士，高级工程师，主要从事色谱分析工作，E-mail: liuajing88@163.com

1. 兰州海关技术中心 兰州 730010

2. 白银市食品检验检测中心 白银 730900

1. Lanzhou Customs Technology Center, Lanzhou 730010

2. Baiyin Food Inspection and Testing Centre, Baiyin 730900

豆芽含有丰富的蛋白质、维生素C、维生素B₂以及游离氨基酸等物质，加之其口感良好，价格便宜，是老百姓餐桌上的家常菜。研究表明，豆芽能有效阻断亚硝酸盐和胺类物质结合，降低癌症发生的概率。原国家食品药品监督管理总局、原农业部、原国家卫生和计划生育委员会发布的《关于豆芽生产过程中禁止使用 6-苄基腺嘌呤等物质的公告》（2015 年第 11 号）规定，不得生产和销售含有6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、赤霉素3种物质的豆芽。但对于其他种类的生长调节剂没有明确的规定，有些不良作坊为谋取私利，在豆芽生产过程中添加植物生长调节剂，以期达到增产增收效果。特别是近年来“毒豆芽”事件频发，因此尽快建立一种豆芽中多种生长调节剂的快速筛查方法，对保障豆芽的质量安全具有重要意义。

通过查阅文献发现，目前针对豆芽中植物生长调节剂检测的方法有高效液相色谱法 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）^[1-2]、气相色谱法（Gas Chromatography，GC）^[3]、气相色谱-质谱法（Gas Chromatography-mass Spectrometry，GC-MS）^[4]、拉曼光谱法^[5]、离子色谱法^[6-7]、高效液相色谱串联质谱法（Ultra-performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）^[8-9]。本研究拟采用高效液相色谱串联质谱法同时测定豆芽中氯吡脲、多效唑、吲哚丁酸、胺鲜酯、噻苯隆、吲哚乙酸6种植物生长调节剂，旨在大幅提高豆芽中多种生长调节剂的检测效率，助力豆芽食品安全监管效能。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

液相色谱质谱联用仪（美国Agilent 6460C，配有电喷雾离子源ESI）；离心机（美国SIGMA，3K30）；涡旋仪（逗点生物，BC-1000）；分析天平（德国Sartorius，BSA822）；氮吹仪（Agela Technologies，NV-15G）。

甲醇、乙腈、甲酸（德国默克，色谱纯）；无水硫酸镁、十八烷基键合硅胶吸附剂（C₁₈），（国药集团，分析纯）；超纯水（屈臣氏）；氯吡脲、多效唑、吲哚丁酸、胺鲜酯、噻苯隆、吲哚乙酸标准物质，具体信息参数见表1。

表1 标准物质信息表

Table 1 Information sheet for reference substances

样品来源：本试验所测豆芽样品90批，分别随机抽取自甘肃省兰州市、白银市、定西市、临夏市4个地市的菜市场、超市流通样品和实验室自发豆芽。

1.2 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC Shield RP₁₈（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：30℃；进样量：2 μL；流速：0.2 mL/min；流动相A：0.1%甲酸水（v/v），流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～1 min，A相从80%降低至50%；1～3 min，A相从50%降低至10%；3～5min，A相从10%上升至80%；5～6 min，A相80%保持不变。

1.3 质谱条件

离子源：电喷雾离子ESI(+)；干燥气温度：300℃；干燥气流速：10 L/min；雾化气压力：3.1×10⁵ Pa；毛细管电压：3.5 kV ；鞘气温度：250℃；鞘气流量：5 L/min；喷嘴电压：1000 V；检测方式：多反应监测（MRM）模式采集数据，具体参数见表2。

1.4 标准溶液的配制

混标标准储备液（100 μg/mL）：准确称取以上标准品，用甲醇定容配制成100 μg/mL的混标标准储备液，-20℃保存。

表2 定性、定量离子对和质谱分析参数

Table 2 Qualitative and quantitative ion pairs and mass spectrometric analysis parameters

注: *为定量离子对

混标标准工作液配制：多效唑、氯吡脲、噻苯隆、胺鲜酯、吲哚乙酸、吲哚丁酸6种标准物质分别用黄豆芽、绿豆芽、扁豆芽的空白基质配制成10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、80 μg/L、100 μg/L、150 μg/L、200 μg/L、500 μg/L的混标标准工作液，-20℃保存。

1.5 样品处理

对现行标准BJS 201703《豆芽中植物生长调节剂的测定》的前处理方法进行改进，称取5 g（精确到0.01g）试样至50 mL离心管中，加入20 mL 1%甲酸乙腈（v/v）溶液，高速匀浆5 min，加入4 g无水硫酸镁、1 g无水乙酸钠后，涡旋2 min，以10000 r/min高速离心5 min。取上层乙腈溶液4 mL放入含300 mg无水硫酸镁和100 mg C₁₈的15 mL离心管中，涡旋1 min，离心，取上清液于45℃水浴中氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，涡旋，离心。上清液过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪进行分析。

2 结果与分析

2.1 样品前处理优化

2.1.1 提取时间的优化

本试验分别考察5 min、10 min、15 min、20 min、30 min 5个不同的提取时间6种目标化合物提取效率的变化，如图1所示。当提取5 min时，6种目标化合物的回收率均大于70%，其中吲哚丁酸的回收率达到了99.5%；当提取增加到10 min时，多效唑的回收率由71.5%下降至71.1%，吲哚乙酸的回收率由92.2%下降至90.8%，但是随着提取时间的增加，这两种化合物回收率又有所增加。因此，从时间成本考虑，本研究最终选用5 min作为豆芽中植物生长调节剂的最佳提取时间。

图1 不同提取时间对目标化合物回收率的影响

Fig.1 The effect of different extraction time on the recovery rate of target compounds

2.1.2 提取溶剂的优化

本试验分别考察甲醇、乙腈和1%甲酸乙腈（v/v）溶液3种不同的提取溶剂对6种目标化合物提取率的影响，结果如图2所示。当提取溶剂选用乙腈后，发现6种目标化合物提取效率全部高于甲醇，因为乙腈使目标化合物能更好地溶解，但是胺鲜酯的回收率依然达不到50%。当加入1%甲酸时，胺鲜酯的回收率达到了80%，吲哚丁酸和氯吡脲的回收率有所降低，但是均超过70%，吲哚乙酸、胺鲜酯、噻苯隆等物质的回收率有了明显提升，分析原因可能是因为甲酸造成豆芽样品中组织细胞的破坏，防止目标化合物羧基的解离，使得提取率更高^[10]。因此，选用1%甲酸乙腈（v/v）作为豆芽中6种植物生长调节剂的提取溶剂。

图2 不同提取试剂对目标化合物回收率的影响

Fig.2 The effect of different extraction reagents on the recovery rate of target compounds

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的优化

试验分别考察了4款不同固定相的色谱柱ACQUITY UPLC BEH C₁₈（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC Shield RP₁₈（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和 ACQUITY UPLC HSS T₃（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、GL Sciences InertSustain AQ -C₁₈（50 mm×2. 1 mm，1.9 μm）对目标物的分离效果，如图3所示。结果表明，在ESI(+)模式下使用HSS T₃、AQ-C₁₈色谱柱时目标化合物响应很低，Shield RP₁₈和 BEH C₁₈色谱柱时化合物响应值较高，同时能实现较好地分离，使用Shield RP₁₈色谱柱时多效唑、氯吡脲、噻苯隆、胺鲜酯4种目标化合物峰形尖锐，峰面积响应值高，主要是因为Shield RP₁₈色谱柱内嵌极性酰胺基团，屏蔽硅醇基，使碱性化合物峰形更佳。

图3 不同色谱柱ESI(+)源目标化合物分离谱图

Fig.3 Separation profiles of target compounds from ESI (+) source on different chromatographic columns

2.2.2 流动相的优化

试验首先考察甲醇和乙腈，发现选用乙腈时绝大多数目标化合物的分离效果优于甲醇，且灵敏度更高。其次，考察水相流动相纯水、0.1%甲酸水（v/v）溶液、5 mmol/L乙酸铵溶液，发现使用0.1%甲酸水时目标化合物的分离效果最好，且峰形尖锐，目标物响应值较高。因此，本试验最终选用的流动相为乙腈和0.1%甲酸水（v/v）溶液。

3 方法学考察

以外标法定量，采用ESI(+)模式，目标化合物峰面积为纵坐标，以其相对浓度为横坐标绘制曲线。可知，6种目标化合物在ESI(+)情况下10～500 μg/L线性范围内线性关系良好，R²＞0.9990。目标化合物以3倍信噪比（S/N = 3）为检出限，以10信噪比（S/N = 10）为定量限，具体参数见表3。

分别在豆芽样品中添加低、中、高（1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L）浓度的6种混合标准溶液，考察方法的回收率和日内日间精密度，最终测得回收率在95%～105%之间，RSD＜4%，其中10 μg/L添加6平行最终测得RSD＜3%。试验结果表明，该方法重现性较好，样品加标回收率高，而且相对标准偏差较小。

表3 线性范围、相关系数、检出限及定量限表

Table 3 Linear range, correlation coefficient, detection limit and quantitative limit table

4 实际样品的测定

采用本试验最终的优化方法随机抽取甘肃省4个不同地市市场上流通和实验室自发的90批豆芽样品进行分析，发现吲哚乙酸和氯吡脲有检出，且氯吡脲检出率达到了75%，结果见表4。

表4 豆芽样品的测定结果

Table 4 The determination results of bean sprouts

在GB 2763—2021《食品中农药最大残留限量》中，对豆芽中氯吡脲、胺鲜酯、噻苯隆均没有明确规定最大限量。本研究通过随机抽取甘肃4个地市市场流通的豆芽样品，发现氯吡脲的检出率达到了75%，分析原因是氯吡脲属低毒植物生长调节剂，能够促进细胞快速分裂，且其生物活性比6-苄基腺嘌呤高10～100倍，是具有细胞分裂素活性的苯脲类植物生长调节剂。此外，现阶段也没有关于氯吡脲毒理学的报道。

5 结论

本研究通过建立超高效液相色谱串联质谱法测定豆芽中的6种植物生长调节剂，该方法采用阴性空白基质配制标准工作液，外标法进行定量，有效消除了基质干扰。该试验方法灵敏度高、重现性好、准确度高，可用于豆芽中多种植物生长调节剂的检测，同时为我国豆芽中农药残留检测和限量制定提供可靠的数据支撑。

参考文献

[1]刘晓婷, 姚拓, 马亚春, 等. 植物根际促生菌发酵液中植物激素含量的液液萃取-高效液相色谱测定法[J]. 草业科学, 2022, 39(10): 2222-2228.

[2]唐晓东, 蒋春志, 徐俊杰, 等. 高效液相色谱法在小麦激素测定中的优化[J]. 河北农业科学, 2021, 25(3): 97-103+108.

[3]王庆彬, 赵红玲, 彭春娥, 等. 气相色谱法同时测定肥料中6种植物生长调节剂[J]. 分析科学学报, 2022, 38(5): 611-616.

[4]刘付英, 杨水艳, 郭颖, 等. QuEChERS-气相色谱–串联质谱法测定粮谷和油料油脂中矮壮素残留[J]. 粮油食品科技, 2022, 30(5): 234-243.

[5] Zhang Ping, Wang Li M, Zheng Da W, et al. Surface-enhanced Raman spectroscopic analysis of N6-benzylaminopurine residue quantity in sprouts with gold nanoparticles[J]. Journal of Environmental Science and Health, Part B, 2018, 53(9): 561-566.

[6]朱作艺, 张玉, 王君虹, 等. 离子色谱法同时测定植物生长调节剂中氯化胆碱、甲哌鎓及N-甲基哌啶[J]. 浙江大学学报(理学版), 2019, 46(3): 333-338.

[7]陈建波, 马琳, 黄兰淇, 等. 离子色谱法测定水溶性肥料中矮壮素和甲哌鎓的含量[J]. 农药, 2022, 61(4): 271-273.

[8]李文博, 童颖. DSPE-HPLC-MS/MS法同时测定豆芽中11种植物生长调节剂和抗生素药物残留[J]. 食品与发酵科技, 2022, 58(4): 123-131.

[9]林芳, 王建山, 丁慧, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定猕猴桃中11种植物生长调节剂残留量[J]. 分析试验室, 2023, 42(2): 241-247.

基金项目：海关技术规范制(修)订计划项目（2021B178）；大连海关科研项目（2022DK05）

第一作者：杨爱馥（1978—），女，汉族，黑龙江齐齐哈尔人，博士，高级工程师，主要从事食品化妆品安全检测工作，E-mail: 1109404462@qq.com

通信作者：杨春光（1971—），男，汉族，辽宁兴城人，硕士，高级工程师，主要从事食品化妆品安全检测工作，E-mail: 2004ycg@163.com

1. 大连海关技术中心 大连 116001

1. Technology Center of Dalian Customs District, Dalian 116001