杨爱馥 田卓 白景莲 刘雪华 杨春光

鱼胶，又称花胶、鱼肚、鱼泡、鱼白、干鱼鳔等，是由鱼类的鳔晒干制成的一类海产品的统称^[1]。鱼胶在我国的药用、食用历史悠久，不仅有多种药理学用途^[2-5]，还具有补充营养、美容养颜、增强体质等功效^[6-8]。因此，鱼胶与燕窝、鱼翅齐名，是“八珍”之一，素有“海洋人参”之誉。

随着国民生活水平的不断提高，消费市场对鱼胶需求量的增加，再加上我国近海渔业资源的衰退，远洋捕捞的投入加大和全球化贸易的进一步加深，世界各地的鱼胶不断涌进我国的消费市场，用于制备鱼胶的鱼种类也由鲈形目石首鱼科鱼类扩大到了其他有鳔的海洋和淡水鱼类^[1]，越来越多种类的鱼鳔在市场上作为花胶售卖，各种名目的花胶多达百余种，来源鱼龙混杂，价格千差万别^[9]。为保证消费者的权益，减少花胶造假或以次充好等现象发生，对其来源鱼种的准确鉴定十分必要。目前，鱼胶还没有权威的鉴定依据，国内已发布实施的SN/T 3589《出口食品中常见鱼类及其制品的鉴伪方法》系列标准中，规定了石斑鱼、安康鱼、鲑鱼、河豚鱼、黄鱼、金枪鱼和鳕鱼成分的鉴定，仅涵盖3个鱼胶种类的鉴定，其他鱼胶种类的鉴定仍处于空白。由于鱼胶样品在干制、油炸或炮制等加工过程中，其DNA会在不同程度上降解^[12]，鱼胶长时间保存也会进一步使DNA降解，很难经传统PCR扩增到较长的DNA片段，因此采用长度约为700 bp的DNA条形码在鱼胶真伪鉴定中的应用受到一定的限制^[11-12]。微型DNA条形码（Mini-DNA Barcoding）技术与传统DNA条形码具有相似的工作原理，但其序列长度短，扩增能力高，可以弥补传统DNA条形码的缺点与不足^[13]。

本研究利用一段扩增片段长度约为200 bp的微型DNA条码引物对线粒体COⅠ基因进行PCR扩增，通过测序和序列比对，确定鱼胶基原鱼种来源，在建立稳定、可靠的鱼胶基原鱼种来源分析鉴定方法的同时，摸底市售鱼胶基原鱼种情况，为国门一线进口鱼胶产品的定种、定价、定税提供技术支持，对加强国际贸易监管、促进我国鱼胶进出口贸易的稳定发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

150份鱼胶样品随机购自全国各大药材销售处、商场超市、批发市场和网络平台，包括具有明确商品名称的71份鱼胶干品和不同品牌的20份即食鱼胶（花胶）。

动物源性植物饲料基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）；磁珠法动物组织基因组DNA提取试剂盒（Promega公司）；高保真DNA聚合酶（TAKARA Ex Taq，5 U/μL）；DNA分子量标记[宝生物工程（大连）有限公司]；无水乙醇（分析纯）、Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇购自国药集团；合成引物、探针及测序由华大基因完成。

T1OO PCR仪购自Bio-Rad 公司；NanoDrop Lite分光光度计购自ThermoFisher公司；5415R小型高速冷冻离心机购自Eppendorf公司；WNB7 7L恒温水浴锅购自Memmert公司；凝胶成像系统购自Bio-Rad公司；电泳仪购自北京六一公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取

方法1：将待检样品依次用70%乙醇和双蒸水冲洗2～3次，剪成细小碎片或研磨成粉末，称取50 mg于1.5 mL离心管中，加入600 μL预热（56℃）的组织裂解液和20 μL蛋白酶K，使用涡旋振荡器振荡混匀，56℃水浴3 h以上或过夜，直至管内液体澄清。12000×g离心10 min，吸取上清液至新的离心管中，加入等体积的Tris饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇（25∶24∶1）混合液，上下颠倒混匀。12000×g离心10 min，吸取上清液至新离心管中；加等体积的三氯甲烷∶异戊醇（24∶1），上下颠倒混匀。12000×g离心10 min，吸取上清液至新离心管中；加入0.8倍体积异丙醇，室温下沉淀1～2 h。12000×g离心10 min，弃上清液；加入1.0 mL 70%乙醇倾斜离心管，轻轻转动数圈后，12000×g离心5 min，弃上清液；用70%乙醇按相同的方法重复洗1次，室温干燥。加入50 μL TE溶解DNA沉淀，于-20℃保存备用。

方法2：按照动物源性植物饲料基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN公司，货号DP323）操作说明进行。

方法3：按照磁珠法基因组DNA提取试剂盒（Promega公司，货号FF3750）操作说明进行。

1.2.2 DNA浓度和纯度的测定

使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260 nm和280 nm处的吸收值。DNA的浓度计算如下

C＝A₂₆₀×N×50 　 (1)

公式（1）中，C为DNA浓度，ng/μL；A₂₆₀为260 nm处的吸光值；N为核酸稀释倍数。

1.2.3 PCR扩增

PCR扩增引物序列见表1^[14]。PCR反应体系见表2。

表2 PCR反应体系

Table 2 PCR reaction system

PCR扩增热循环：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳

用1×TAE电泳缓冲液配制含1 μg/mL溴化乙锭或Gold View核酸染料的2%琼脂糖凝胶。取5 μL PCR扩增产物与适量加样缓冲液混合进行电泳检测，设DNA Marker同步电泳；采用5～8 V/cm恒压电泳进行约30 min，此时溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部，用凝胶成像仪观察电泳结果并记录。

1.2.5 电泳结果

检测设置阳性对照和空白对照，用已知含鱼类成分的样品做阳性对照，用无菌双蒸水做空白对照；当阳性对照扩增片段大小约为200 bp、空白对照无扩增片段时，结果成立。此时，若待测样品出现约200 bp扩增片段则判断该样品PCR扩增结果阳性，无扩增片段或片段大小不符则判断为PCR扩增结果阴性。

1.2.6 测序和比对

将PCR扩增结果阳性产物进行测序，测序引物使用通用引物M13F^(-21)C和M13R^(-27)C。测序结果通过BOLD（http://www.boldsystems.org）和NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）网站对样品的COⅠ序列进行鉴定及相似度分析。

2 结果与讨论

2.1 鱼胶基因组DNA提取方法比较

分别采用1.2.1节所述中的3种方法对鱼胶样品进行DNA提取，比较3种方法提取效果，见表3。3种方法提取的DNA浓度和纯度均可满足后续PCR扩增和测序，Promega公司的磁珠法基因组提取试剂盒（方法3）提取DNA的浓度最大，但试剂盒成本较高；而天根公司生产的动物源性植物饲料基因组DNA提取试剂盒（方法2）提取方法简单、快速，成本较低，适于推广应用。

表3 不同方法提取DNA效果比较

Table 3 Comparison of different DNA extraction methods

2.2 COⅠ基因扩增和序列比对

本研究PCR扩增COⅠ基因目的片段约为200 bp，代表性样品PCR扩增电泳结果如图1所示。将PCR扩增产物进行测序，测序引物使用通用引物M13F^(-21)C和M13R^(-27)C。测序后的结果在BOLD和NCBI数据库中进行序列比对，相似度均在98%以上。鱼胶样品PCR扩增后产物测序比对结果见表4，在150份鱼胶样品中共鉴定出12科24种鱼类，包括石首鱼科的大黄鱼、小黄鱼、长体似牙䱛、毛里塔尼亚似牙䱛、短鳍犬牙石首鱼、苏里南犬牙石首鱼、绿色犬牙石首鱼、短鳍犬牙石首鱼和矮犬牙石首鱼；鲟科的达氏鳇；海鳗科的粗犁齿海鳗、百吉海鳗（褐海鳗）；鼬鳚科的克氏须鼬鳚、须鼬鳚和多须鼬鳚；黑鲉科的裸盖鱼（银鳕鱼）；鲑科的大西洋鲑；鳕科的大西洋鳕鱼、黄线狭鳕（阿拉斯加狭鳕）；无须鳕科的太平洋无须鳕；鲑科的驼背大麻哈鱼；尖吻鲈科的尼罗尖吻鲈；鷶科的低眼无齿鷶；鲭科的黄鳍金枪鱼。

注: M-DL2000 Marker Plus; P为阳性对照; 1～15代表性待检目标样品; 鳕鱼胶、鳕鱼胶、黄花胶、黄花胶、黄花胶、蝴蝶胶、北海鱼胶、北海鱼胶、白花鱼胶、蜘蛛胶、鳌鱼胶、安南鱼胶、金钱胶、鳗鱼胶、金龙胶; B-为空白对照(灭菌双蒸水).

图1 代表性样品PCR扩增产物电泳图

Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification products of representative samples

2.3 市售鱼胶基原鱼种鉴定

市售鱼胶形态多种多样，商品名称千差万别，标签上显示其来源鱼种繁多，根据鱼胶形态和商品名称难以识别和判断鱼胶基原鱼种，难以辨别真伪。本研究采用微型DNA条形码技术，对收集到的市售具有明确商品名称的71份鱼胶干品和20份不同品牌的即食鱼胶（花胶）进行来源鱼种检测，结果见表5。尼罗尖吻鲈在商品名称为黄花胶、白花鱼胶、蜘蛛胶和鳌鱼胶中均被检出；苏里南犬牙石首鱼在商品名称为北海鱼胶和鳌鱼胶中被检出，绿色犬牙石首鱼在商品名称为北海鱼胶和金钱胶中被检出。黄花胶、白花鱼胶、蜘蛛胶、鳌鱼胶、北海鱼胶、金钱胶的价格差异较大，亟须相关的行业标准来规范我国鱼胶市场。

Hajibabaei等^[15]提出微型DNA条形码，并对哥斯达黎加地区的寄生蜂进行了鉴定。Fields等^[16]利用微型DNA条形码对市售鱼翅进行检测，通过对鱼翅来源进行溯源，防止对珍稀鲨鱼的捕杀。Armani等^[17]对市售鲷鱼及制品进行鉴定，结果表明微型DNA条形码具有很好的适用性。陈文炳等^[18]利用微型DNA条形码对美洲鳗、欧洲鳗和日本鳗进行物种鉴定。此外，甲壳类动物也可利用微型DNA条形码技术进行准确鉴定^[19]。Labrador等^[11]对菲律宾的39份沙丁鱼样品进行抽查，结果发现标准DNA条形码无法扩增出序列片段，而微型DNA条形码则可对64%的样品进行鉴定。林柏岸^[1]采用标准DNA条形码对完整花胶样品、油炸花胶样品和花胶碎片样品的鉴定成功率分别为57.94%、10.26%和34.61%。本研究也采用标准DNA条形码对鱼胶样品DNA进行扩增，成功率约为30%，而微型DNA条形码鉴定成功率为100%，可见微型DNA条形码技术更适用于深加工样品的物种鉴定。

3 结论

本研究以COⅠ基因为目标基因，采用微型DNA条形码技术对150份鱼胶及制品进行PCR扩增、测序，鉴定成功率为100%，表明微型DNA条形码适用于鱼胶基原鱼种鉴定。对于市售具有明确商品名称的71份鱼胶干品的鉴定结果显示，商品名称与基原鱼种对应关系混乱，商品标签上无明确鱼种种类标识等现象严重，需加强对鱼胶产品基原鱼种标识重视及鉴定技术的开发，强调标签符合性与国际行业要求接轨。本研究对推动我国鱼胶质量控制体系的构建具有积极作用，对扩大我国鱼胶进出口贸易的稳定发展、保障人民群众的合法权益具有重要意义。

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表1 通用微型基因条形码引物序列信息表

Table 1 General microgene barcode primer sequence information table

注: 斜体加粗为M13F^(-21)C、M13R^(-27)C标签

表4 鱼胶样品PCR扩增产物序列比对结果

Table 4 Sequence comparison results of PCR amplified products from fish gum samples

表5 市售鱼胶及制品检测结果

Table 5 Test results of fish maw and products on the market

基金项目：辽宁省科学技术计划项目（2017225067）

第一作者：曲世超（1985—），男，汉族，辽宁铁岭人，硕士，工程师，主要从事分子生物学检测工作，E-mail: qushichao09@126.com

通信作者：齐欣（1984—），女，汉族，河北昌黎人，硕士，高级工程师，主要从事分子生物学检测工作，E-mail: 110697186@qq.com

1. 大连海关技术中心 大连 116000

2. 丹东海关 丹东 118000

3. 大连国际旅行卫生保健中心 大连 116001

1. Technology Center of Dalian Customs District, Dalian 116000

2. Dandong Customs, Dandong 118000

3. Dalian International Travel Healthcare Center, Dalian 116001