孔政 丁一 杜照中 焦伯延 韩淑琪

Abstract A total of 140 poultry meat samples were collected and tested for Yersinia enterocolitica in accordance with the procedures and methods prescribed in the Manual for China National Food Contamination and Harmful Factors Risk Monitoring in 2021 and Manual for China National Food Contamination and Harmful Factors Risk Monitoring in 2022. Antibiotic susceptibility tests and whole-genome sequencing analysis were performed on the isolated strains. The detection rate of Yersinia enterocolitica was 4.3% (6/140), with a higher detection rate of 7.5% (6/80) in raw poultry meat and no detection in cooked poultry products. Among the six isolated strains, five were sensitive to all fifteen antibiotics tested, and one strain was resistant to ciprofloxacin and naphthenic acid. Six whole-genome sequences of Yersinia enterocolitica were obtained and classified into five sequence types (STs). Five strains carried the virulence genes ystB, myfA, and invA, while one strain carried the virulence genes ystB and myfA. There is a certain degree of Yersinia enterocolitica contamination in raw poultry meat in Jining City, with polymorphic distribution of STs, presence of virulence genes, and a small number of strains developing resistance. Monitoring efforts for Yersinia enterocolitica should be strengthened.

Keywords Yersinia enterocolitica; antibiotic resistance; whole-genome sequencing; virulence genes

小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）是革兰氏阴性杆菌或球杆菌，无荚膜，有周鞭毛，具有嗜冷特性，能够在低温环境生长，反复冻融后仍具有活性^[1-3]。小肠结肠炎耶尔森氏菌感染可以引起腹泻、胃肠炎、发热和败血症，是重要的食源性致病菌之一^[4-6]。为了解济宁市禽肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌分布情况，本研究对济宁市的生禽肉和熟禽肉制品开展小肠结肠炎耶尔森氏菌的分离鉴定，对分离的菌株进行药敏检测和全基因组测序，分析济宁市禽肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌的分布情况、耐药情况、毒力情况和全基因组特征，为预防和控制小肠结肠炎耶尔森氏菌感染引起的食源性疾病提供依据。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

恒温恒湿箱购自德国宾得公司；VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统购自法国梅里埃公司；细菌鉴定/药敏分析仪购自山东鑫科生物科技股份有限公司；均质器购自法国AES公司。

CIN-1培养基、改良Y培养基、改良克氏双糖培养基和营养琼脂均购自广东环凯生物科技有限公司；革兰阴性需氧菌药敏检测板购自上海星佰生物技术有限公司。

1.2 样本来源

依据《2021年国家食品污染物和有害因素风险监测工作手册》和《2022年国家食品污染物和有害因素风险监测工作手册》采样方法，2021—2022年在济宁市采集140份禽肉样本，其中2021年采集生禽肉20份；2022年采集生禽肉60份和熟禽肉制品60份，每次采样完成后2 h内送至济宁市疾病预防控制中心食品微生物实验室。

1.3 小肠结肠炎耶尔森氏菌培养和鉴定

按照GB 4789.8—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》方法，所有样品均在无菌条件下进行处理，取25 g样品放入含有225 mL改良磷酸盐缓冲液增菌液的无菌均质袋中，用拍击式均质器均质1 min。均质后于26℃增菌48 h。取增菌液0.5 mL，加入碱处理液4.5 mL后充分混匀后，接种在CIN-I琼脂平板和改良Y琼脂平板，26℃培养48 h。挑取可疑菌落5个，分别接种在改良克氏双糖铁琼脂，26℃培养24 h，将斜面和底部皆变黄不产气的培养物，用接种环挑取一满环培养物，接种到尿素培养基上，26℃培养4 h。将尿素酶试验阳性菌落分别接种于两管半固体培养基中，26℃和36℃培养24 h。将在26℃有动力而36℃无动力的可疑菌培养物划线接种营养琼脂平板，进行纯化培养。利用VITEK2 Compact全自动微生物分析系统对纯培养的单个菌落进行鉴定。

1.4 药敏检测

采用微量肉汤法进行药物敏感性试验，根据革兰阴性需氧菌药敏检测板使用说明书并结合菌落特性，将菌悬液调至0.5麦氏浊度，接种至药敏板，经过26℃孵育16～20 h后，根据反应孔的浑浊、清晰度肉眼判读得出数据，其中混浊为阳性，清晰为阴性。根据美国临床和实验室标准化协会标准判定小肠结肠炎耶尔森氏菌对抗生素的敏感和耐药结果。共检测15种抗生素，分别是氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、四环素、美罗培南、多黏菌素E、厄他培南、替加环素、头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星、氯霉素、萘啶酸、链霉素、复方新诺明和阿米卡星。

1.5 基因测序和分析

提取细菌DNA后，由北京诺禾致源生物科技有限公司进行全基因组测序，利用CLC Genomics Workbench 21软件进行小肠结肠炎耶尔森氏菌基因组序列的拼接。利用EnteroBase数据库分析软件，选择McNally 7 Gene，通过对核心基因组进行序列分型（sequencing typing，ST）分析；利用EnteroBase数据库分析软件单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）构建核心基因组进化树。利用致病菌毒力因子（virulence factors of pathogenic bacteria，VFDB）数据库的VFanalyzer分析小肠结肠炎耶尔森氏菌的黏附侵袭位点基因（attachment-invasion locus gene，ail）、小肠结肠炎耶尔森氏菌耐热肠毒素A基因（heat-stable enterotoxin A gene of Yersinia enterocolitica，ystA）、小肠结肠炎耶尔森氏菌耐热肠毒素B基因（heat-stable enterotoxin B gene of Yersinia enterocolitica，ystB）、耶尔森氏菌黏附素A基因（Yersinia adhesin A，yadA）、毒力调节因子基因（virulence regulon，virF）、耶尔森氏菌黏液因子A基因（mucoid Yersinia factor A，myfA）、侵袭素A基因（invasin A，invA）、耶尔森氏菌外膜蛋白基因（Yersinia outer protein antigens，yop）等毒力基因。

1.6 统计学分析

使用SPSS 22.0软件进行fisher确切概率法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小肠结肠炎耶尔森氏菌总体检出情况

2021—2022年共采集140份样本，6份样本检出小肠结肠炎耶尔森氏菌，检出率为4.3%（6/140）。其中，2021年小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率为5.0%（1/20），2022年小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率为4.2%（5/120），2021年和2022年小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率差异无统计学意义（P = 0.41）。见表1。

表1 2021—2022年小肠结肠炎耶尔森氏菌检出情况

Table 1 Detection rate of Yersinia enterocolitica from 2021 to 2022

2.2 不同种类食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检出情况

在生禽肉中，小肠结肠炎耶尔森氏菌检出率为7.5%（6/80），而在熟禽肉制品中未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌（0/40）。在生禽肉和熟禽肉制品小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率差异有统计学意义（P = 0.032）。见表2。

表2 不同种类食品小肠结肠炎耶尔森氏菌检出情况

Table 2 Detection rate of Yersinia enterocolitica in different types of foods

2.3 药敏检测结果

对分离的6株小肠结肠炎耶尔森氏菌进行15种抗生素药敏检测，其中5株菌株对15种抗生素均敏感，占比83.3%（1/6）；1株菌株对环丙沙星和萘啶酸同时发生了耐药，占比16.7%（1/6）。

2.4 全基因组测序结果

2.4.1 ST分型和进化树分析

对分离的6株小肠结肠炎耶尔森氏菌进行全基因组测序，获得6条序列长度为4.66～4.81 Mb的全基因组序列，将序列上传至EnteroBase数据库，获得的EnteroBase数据库序列号分别为YER_AA8965AA、YER_AA8966AA、YER_AA8967AA、YER_AA8968AA、YER_AA8969AA、YER_AA8970AA。利用EnteroBase数据库对6株小肠结肠炎耶尔森氏菌的核心基因组序列进行ST分型分析，6株菌株分5个ST型，分别为ST3型、ST493型、ST542型、ST783型和ST783型，其中有2株菌株均为ST783型，见表3。利用EnteroBase数据库对7个核心基因组序列构建ST系统发育树，在发育树上，6株共分为2个分支，如图1所示。

表3 小肠结肠炎耶尔森氏菌ST分型结果

Table 3 ST typing results of Yersinia enterocolitica

图1 核心基因组序列发育树

Fig.1 Phylogenetic tree of core genome

of Yersinia enterocolitica

2.4.2 毒力基因分析

利用VFDB数据库的VFanalyzer分析6株菌株全基因组序列的毒力基因，结果显示，6株菌株均含有ystB和myfA毒力基因，5株含有invA毒力基因，均不含有ail、ystA、yadA、virF和yop毒力基因。见表4。

表4 小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因分析结果

Table 4 Virulence gene analysis results of virulence genes of Yersinia enterocolitica

注: “+”代表 含有相关毒力基因; “－”代表不含有相关毒力基因

3 讨论

2021—2022年在济宁市采集的禽肉食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率为4.3%（6/140），与新乡市检出率相近^[7]，低于南昌市和温州市检出率^[8-9] （χ² = 13.9，P＜0.001），高于河南省和重庆市检出率^[10-11] （χ² = 23.0，P＜0.0001），说明小肠结肠炎耶尔森氏菌的分布存在地域差异。此外，仅在生禽肉中检出小肠结肠炎耶尔森氏菌，检出率为7.5%，因小肠结肠炎耶尔森氏菌能够适应低温环境，冷藏条件下小肠结肠炎耶尔森氏菌仍存在活性和繁殖特性，因此不宜长久贮藏生禽肉^[2-3]。而熟禽肉制品未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌，说明小肠结肠炎耶尔森氏菌可能在熟禽肉制品加工过程中被消灭，因此加工禽肉的刀具、案板应该生熟分开，食用禽肉时应该完全加热，降低小肠结肠炎耶尔森氏菌感染风险。超市和农贸市场售卖生禽肉多以冷藏或冻藏方式为主，而低温贮藏可能增加小肠结肠炎耶尔森氏菌检出风险，因此应当加大对冷藏食品小肠结肠炎耶尔森氏菌的监测力度。

目前，对小肠结肠炎耶尔森氏菌药敏检测的研究报道较少，本研究对分离的6株小肠结肠炎耶尔森氏菌进行15种抗生素的药敏实验，结果显示，5株菌株对15种抗生素均敏感，1株发生了对喹诺酮药物环丙沙星和萘啶酸的同时耐药，药敏检测结果与温州市的研究相似^[9]。结果说明，在济宁市常见抗生素治疗小肠结肠炎耶尔森氏菌感染具有较好的作用。研究报道，在高密市2006—2011年采集的样品中，有94.5%的菌株对2种以上的抗生素耐药，并发现1株对7种抗生素耐药的菌株^[12]，而在济宁市仅少部分菌株发生了耐药，说明不同地区、不同时间小肠结肠炎耶尔森氏菌抗菌药物敏感性存在差异，且存在产生耐多种抗生素菌株的风险，因此应当长时间开展小肠结肠炎耶尔森氏菌的药敏检测，为临床治疗小肠结肠炎耶尔森氏菌感染提供参考数据。

全基因组测序是利用高通量DNA测序技术，快速获得对个体的全基因组序列的方法。随着近几年全基因组测序技术的高速发展，全基因组测序技术已经广泛应用于细菌的鉴定、分型和溯源分析^[13]。ST技术对细菌核心基因组进行序列分析，能够将细菌分成克隆菌群，有利于发现导致食源性疾病的优势克隆菌群，进行追踪溯源^[14-15]。目前利用EnteroBase数据库是进行小肠结肠炎耶尔森氏菌ST分型分析的最主要分析方法^[16-17]。

本研究对6株菌株分型分析，显示济宁市小肠结肠炎耶尔森氏菌呈多态分布，共分为5个ST型。在核心基因组构建的ST系统发育树上，6株共分为2个分支，其中5株菌株位于同一发育树。然而，目前我国对食品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌开展全基因组测序分析的报道较为少见，今后需要加强小肠结肠炎耶尔森氏菌的分离和测序，丰富ST分型数据，为食品安全风险评估和食源性疾病溯源分析提供依据。

ystB编码的肠毒素是小肠结肠炎耶尔森氏菌致腹泻的主要因素之一，在食源性感染的发病机制中起着极其重要的作用；myfA编码的类黏蛋白MyfA具有很强的免疫原性，在小肠结肠炎耶尔森氏菌感染初期发挥关键作用，能够促进小肠结肠炎耶尔森氏菌与宿主肠细胞的黏附；invA编码的侵袭因子InvA不仅在黏附和侵袭过程中发挥关键作用，而且具有较强的细胞毒性，能够引发宿主炎症反应和细胞裂解^[18-19]。对6株菌株的全基因组序列进行毒力基因分析，结果显示，6株菌株均含有ystB和myfA，5株含有invA，说明这些菌株可能具有一定的致病力，可能存在引发食源性疾病的风险。

4 结论

综上所述，在生禽肉中存在小肠结肠炎耶尔森氏菌，含有一定数量的毒力基因，多数菌株对常见抗生素均敏感，有引起食源性疾病的潜在风险。此外，本研究获得了济宁市的小肠结肠炎耶尔森氏菌全基因组序列信息，为食品安全风险评估和食源性疾病溯源分析提供了数据支撑。

参考文献

[1] Odyniec M, Bancerz-Kisiel A. Assessment of the Role of Free-Living and Farmed Fallow Deer (Dama dama) as A Potential Source of Human Infection with Multiple-Drug-Resistant Strains of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis[J]. Pathogens, 2022, 11(11): 1266. DOI: 10.3390/pathogens11111266.

[2] Hassanzadeh P, Ghasemzadeh Limoee E, Nouri Gharajalar S, et al. Molecular detection, biotyping and serotyping of Yersinia enterocolitica isolated from chicken livers in Tabriz[J]. Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2022, 83: 101777. DOI: 10.1016/j.cimid.2022.101777.

[3]张彦春, 张爽, 杨杰, 等. 自腹泻病例和家用冰箱分离的小肠结肠炎耶尔森菌病原特征分析[J]. 中国食品卫生杂志, 2018, 30(6): 582-585.

[4]于恩庶. 中国小肠结肠炎耶尔森氏菌病研究进展[J]. 中华流行病学杂志, 2000(6): 53-55.

[5]吴清平, 胡惠娟, 张菊梅, 等. 食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌生物学特性和分子分型研究进展[J]. 食品科学技术学报, 2014, 32(4): 1-7.

[6] Ragno V M, Uehlinger F D, Gabadage K, et al. Investigation of a Yersinia enterocolitica outbreak in a commercial alpaca farm in Saskatchewan[J]. The Canadian veterinary journal=La revue veterinaire canadienne, 2019, 60(8): 877-882.

[7]史晓娟, 魏红霞, 周宇鑫, 等. 2019—2021年新乡市食品安全风险监测结果分析[J]. 口岸卫生控制, 2022, 27(6): 9-12.

[8]吴鑫, 章志超, 刘德, 等. 2018—2019年南昌市市售生鲜肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌污染情况分析[J]. 食品安全质量检测学报, 2020, 11(13): 4214-4218.

[9]谢爱蓉, 上官智慧, 谢中必, 等. 温州市食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌分布及分子分型研究[J]. 中国食品卫生杂志, 2022, 34(5): 902-906.

[10]崔莹, 李艳芬, 戚浩彧, 等. 2019年河南省市售生禽肉食源性致病菌污染状况分析[J]. 河南预防医学杂志, 2021, 32(8): 587-590.

[11]黄莉萍, 罗书全. 2018—2020年重庆市市售冷藏冷冻动物源食品致病微生物污染状况分析[J]. 食品安全质量检测学报, 2021, 12(10): 4286-4291.

[12]孙文魁, 毕振旺, 寇增强, 等. 163株小肠结肠炎耶尔森菌的抗菌药物敏感性分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2013, 29(4): 339-342.

[13]畅晓晖. 基于全基因组测序的致病菌分型溯源技术研究进展[J]. 中国口岸科学技术, 2021, 3(S1): 41-47.

[14] Kimura B. Will the emergence of core genome MLST end the role of in silico MLST[J]. Food Microbiol, 2018, 75: 28-36.

[15] 姬小薇, 廖亚玲, 毛旭虎, 等. MLST分析在病原微生物基因分型应用中的研究进展[J]. 国际检验医学杂志, 2011, 32(2): 246-249.

[16] Zhou Z, Alikhan N F, Mohamed K, et al. The EnteroBase user’s guide, with case studies on Salmonella transmissions, Yersinia pestis phylogeny, and Escherichia core genomic diversity[J]. Genome Res, 2020, 30(1): 138-152.

[17] Yue Y, Shen M, Liu X, et al. Whole-genome sequencing-based prediction and analysis of antimicrobial resistance in Yersinia enterocolitica from Ningxia, China[J]. Front Microbiol, 2022, 13: 936425. DOI: 10.3389/fmicb.2022.936425.

[18] Bancerz-Kisiel A, Pieczywek M, Łada P, et al. The Most Important Virulence Markers of Yersinia enterocolitica and Their Role during Infection[J]. Genes (Basel), 2018, 9(5): 235. DOI:10.3390/genes9050235.

[19] Platt-Samoraj A. Toxigenic Properties of Yersinia enterocolitica Biotype 1A[J]. Toxins (Basel), 2022, 14(2): 118. DOI: 10.3390/toxins14020118.

第一作者：张彩丽（1983—），女，汉族，山东菏泽人，硕士，副高级工程师，主要从事大宗资源货物查检工作，E-mail: zhangcailiciq@163.com

通信作者：陈哲（1989—），男，汉族，陕西绥德人，本科，工程师，主要从事大宗资源货物查检工作，E-mail: 316074510@qq.com

1. 日照海关 日照 276826

2. 黄岛海关 黄岛 266555

1. Rizhao Customs, Rizhao 276826

2. Huangdao Customs, Huangdao 266555