李献锋 于璇 胡淑青 李盼畔 冯黎霞 袁俊杰 邵宝林 魏霜

玉米褪绿斑驳病毒（maize chlorotic mottle virus，MCMV）属于番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）玉米褪绿斑驳病毒属（Machlomovirus），是我国进境植物检疫性有害生物^[1]，其寄主主要为玉米（Zea mays L.）和甘蔗（Saccharum officinarum L.），可通过机械、种子、土壤和虫媒传播^[2]。1974年MCMV在秘鲁被首次报道^[3]，随后扩散到美国、巴西和阿根廷等美洲地区^[4-6]。2010年以来，MCMV在肯尼亚、卢旺达和埃塞俄比亚等非洲东北部迅速蔓延^[7-10]。在我国，MCMV仅分布于台湾地区^[11]，中国大陆曾于2009年和2013年在云南省和四川省短暂监测到MCMV ^[1,12]，此后无相关报道。MCMV单独侵染玉米引起花叶、褪绿斑驳、节间变短、植株矮化和穗发育畸形等症状，自然侵染可造成10%～15%的损失，人工接种可导致59%的损失^[13]。此外，MCMV可与马铃薯Y病毒科（Potyviridae）多种病毒复合侵染造成玉米致死性坏死病（Maize lethal necrosis，MLN），造成叶片褪绿斑驳、新叶坏死，雄性不育，穗发育畸形和腐烂，最终导致植株死亡，平均可造成75%～90%的产量损失^[4,6]。

近年来，MCMV有进一步扩散蔓延趋势。中国是玉米生产大国，据国家统计局数据，近几年我国播种面积稳定在4000万hm²以上，玉米的安全生产与我国粮食安全战略密切相关。据魏鹏等^[14]研究推测，在不防控场景下，MCMV每年对我国玉米产业潜在的经济损失超过400亿元，该病毒已成为制约我国玉米产业的潜在威胁。目前，尚未有针对MCMV的高抗性玉米品种和特效防治药剂，因此，MCMV的早期诊断对其防控至关重要。本文综述了国内外关于MCMV分子检测方法的研究进展，以期为MCMV的病害诊断和检疫防控提供参考。

1 基于核酸变温扩增的PCR方法

1.1 常规RT-PCR方法

早期MCMV的鉴定主要依据常规RT-PCR结合测序分析的方法，已报道的MCMV的常规RT-PCR方法主要针对外壳蛋白（coat protein，CP）基因作为检测靶标，如龚海燕等^[15]和雷屈文等^[16]建立了两步RT-PCR检测体系，分别从美国和泰国进境的玉米种子中检出MCMV；Xie等^[12]建立了两步RT-PCR体系，首次报道中国云南省发现MCMV为害玉米，并确认MCMV可以自然侵染高粱（Sorghum bicolor L.）和薏仁（Coix chinensis Tod.）；单长林等^[17]、Chen等^[18]和Mwatuni等^[19]分别建立了MCMV的两步RT-PCR检测体系，用于验证其建立的RT-LAMP方法的灵敏度。然而，上述两步RT-PCR方法需经过反转录合成cDNA步骤，操作较为繁琐、耗时，且易出现污染。Deng等^[11]建立了一步法RT-PCR体系，首次报道中国台湾发现MCMV侵染玉米，并确认MCMV可经威廉斯花蓟马（Frankliniella williamsi Hood）传播；闻伟刚等^[20]建立了一步RT-PCR检测体系，对玉米粗缩病毒（maize rough dwarf virus，MRDV）、玉米矮花叶病毒（maize dwarf mosaic virus，MDMV）和小麦线条花叶病毒（wheat streak mosaic virus，WSMV）无交叉反应，可检测稀释10^-3倍病毒RNA样品。此外，Wangai等^[7]针对编码P111蛋白（111 kDa protein，P111）的基因为靶标建立了一步RT-PCR检测体系，首次报道在肯尼亚和刚果发现MCMV为害玉米^[8]；张露茜等^[21]基于MCMV基因组5'端非翻译区和P32基因为靶标建立了一步RT-PCR体系，该体系与MDMV、南芥菜花叶病毒（arabis mosaic virus，ArMV）和烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）无交叉反应，对玉米叶片RNA的灵敏度低至1.61×10⁻⁴ ng/反应。此外，Wu等^[22]建立了一种免疫捕捉（immunocapture）IC-RT-PCR方法，该方法对甘蔗花叶病毒（sugarcane mosaic virus，SCMV）、南方水稻黑条矮缩病毒（southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）和水稻黑条矮缩病毒（rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）均无交叉反应，对MCMV的灵敏度达到2.5×10⁻⁵ ng/μL，灵敏度是其建立的ELISA方法的10倍。

上述研究均采用叶片或将种子萌发后再选取幼叶提取总RNA进行RT-PCR检测，目前，针对种子样品直接进行检测的研究报道相对较少。Bernardo等^[23]针对P111基因为靶标建立了一步RT-PCR检测体系，并应用于玉米种子的检测验证，结果表明，该体系特异性强，对玉米坏死条纹病毒（maize necrotic streak virus，MNeSV）、小麦花叶病毒（wheat mosaic virus，WMoV）和WSMV等10种病毒无扩增反应，对MCMV灵敏度低至10^-5 ng/反应，从60份玉米种子浸泡液中检出MCMV阳性样品30份，检出率高达50%。

1.2 实时荧光RT-PCR方法

与常规RT-PCR方法相比，实时荧光RT-PCR方法的特异性更强、灵敏度更高，且无需电泳和EB染色，能有效避免存在的安全隐患，并极大地缩短检测时间，因此，实时荧光RT-PCR方法已成为当前植物病毒检测的最重要手段之一^[24-25]。实时荧光RT-PCR根据荧光采集的方式不同可以分为染料法和探针法。

张露茜等^[21]基于SYBR Green I荧光染料建立了MCMV的实时荧光RT-PCR检测体系，对叶片总RNA的检测低限为7.86×10⁻⁶ ng/反应，灵敏度是常规RT-PCR的10倍；Stewart等^[26]通过优化基于SYBR Green I染料的体系，实现了实时荧光RT-PCR一步法检测MCMV，Bernardo等^[23]采用该体系检测玉米种子携带的MCMV，其最低检测灵敏度为10^-5 ng/反应，是ELISA方法的3000倍。然而，SYBR Green I等荧光染料与双链DNA结合不具有特异性，无法排除引物二聚体和非特异性扩增产物，在实际使用中受限，因此，特异性更强、稳定性更好的探针法更受青睐。Adams等^[27]基于一种新型TaqMan探针，研发了一种实时荧光RT-PCR体系，对MCMV具有更高的检测灵敏度和特异性。

为减少实验室内部核酸交叉污染而导致假阳性结果，通常针对CP基因、3'端非编码区等多个分子靶标进行检测。如Liu等^[28]基于MCMV的3'端非编码区的保守序列设计1组引物和探针，建立了TaqMan实时荧光RT-PCR体系，该体系对MDMV、ArMV和TRV等7种病毒无交叉反应，对玉米叶片总RNA的灵敏度为1.6×10⁻⁵ ng/反应，是常规RT-PCR方法的252倍；Zhang等^[29]针对MCMV CP基因为靶标建立了TaqMan实时荧光RT-PCR体系并应用于种子样品检测，该体系对MCDV、WSMV、SCMV和MDMV无交叉反应，对携带MCMV的叶片总RNA和体外合成RNA的检测灵敏度分别为4×10⁻⁶ ng/μL和25拷贝数/μL，均是常规RT-PCR的10倍，该方法特异性强、灵敏度高，可以实现单粒玉米种子携带MCMV的检测。

1.3 多重RT-PCR方法

多重RT-PCR方法是多对引物和探针加到同一反应体系中同时检测多种靶标，适用于多种病毒复合侵染或同一种病毒的多个靶标基因的检测。MCMV可以与马铃薯Y病毒科的多种病毒复合侵染引起MLN，因此，针对MCMV等多种病毒建立多重RT-PCR方法可以有效提高检测效率。Li等^[30]建立了一种多重RT-PCR方法，同时检测MCMV、SCMV、玉米黄化花叶病毒（maize yellow mosaic virus，MaYMV）和玉米相关的整体病毒（maize-associated totivirus，MATV），该方法特异性强，灵敏度与常规RT-PCR相当，并以玉米EF 1α基因作为扩增内标指示PCR反应的假阴性，能有效提高检测效率。

2 等温扩增方法

2.1 逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）方法

逆转录环介导等温扩增（reverse transcription-loop mediated isothermal amplification，RT-LAMP）方法是针对靶基因的多个特定区域设计多对引物，利用链置换型DNA聚合酶在60～65℃恒温条件下进行反应实现核酸扩增，无需长时间温度循环、繁琐的电泳和紫外观察等过程，且具有良好的特异性和灵敏度，适合现场快速检测。单长林等^[17]等根据MCMV CP基因序列建立了两步RT-LAMP体系，该体系仅需在64℃条件下反应45 min，对感染MCMV的玉米叶片总RNA的灵敏度为2.8×10^-4 ng/μL，是RT-PCR的100倍，对100份模拟MCMV感染的玉米种子的检出率为100%。该方法操作简单、耗时短，且加入荧光试剂钙黄素可实现检测结果可视化，但需进行反转录合成cDNA，过程较为繁琐，容易受交叉污染出现假阳性结果。

近年来，已有多种MCMV的一步法RT-LAMP检测体系被建立，Chen等^[18]等针对MCMV的CP基因为靶标建立了一步法RT-LAMP体系，该体系需在63℃条件下反应60 min，与白草花叶病毒（pennisetum mosaic virus，PenMV）、SCMV和RBSDV无交叉反应，对MCMV阳性叶片总RNA的灵敏度低至2.5×10^-2 ng/反应，是常规RT-PCR方法的10倍，从23份疑似MCMV感染的玉米叶片样品中检出16份阳性，而常规RT-PCR方法仅检测出14份阳性，具有较好的检测效率，在加入SYBR Green I染料时可实现检测结果可视化。Xu等^[31]同样针对MCMV的CP基因建立了一步法RT-LAMP体系，该体系需在61℃条件下反应60 min，对燕麦花叶病毒（oat mosaic virus，OMV）、番茄环斑病毒（tomato ringspot virus，ToRSV）、MCDV、WSMV和MRDV无交叉反应，对携带MCMV的叶片总RNA的灵敏度低至0.02 ng/反应，与常规RT-PCR相当，实际样品盲样检测时与添加钙黄素的荧光染料法的判读检测结果一致。Liu等^[32]根据MCMV的CP基因和3'-UTR序列设计了特异性引物，建立了一步RT-LAMP检测体系，在64℃条件下反应60 min后，加入羟基萘酚蓝可用裸眼观察判读检测结果，该体系对建兰花叶病毒（cymbidium mosaic virus，CymMV）、南方菜豆花叶病毒（southern bean mosaic virus，SBMV）和百合无症病毒（lily symptomless virus，LSV）等6种病毒无交叉反应，对携带MCMV的玉米叶片RNA的灵敏度为4.8×10^-3 ng/μL，与常规RT-PCR相当。Mwatuni等^[19]针对MCMV的CP基因序列为靶标建立了一步RT-LAMP检测体系，该体系在61℃条件下，加入SYBR greenⅠ染料时反应60 min后可在紫外光下观察检测结果，也可反应10～20 min在Genie Ⅱ 平台观察扩增曲线快速读取结果，该体系对叶片RNA的检测灵敏度低至2.5×10^-6 ng/μL，与实时荧光RT-PCR方法相当，是常规RT-PCR方法的100倍。

2.2 逆转录重组聚合酶扩增（RT-RPA）方法

逆转录重组聚合酶扩增方法（reverse transcription-recombinase protein amplification，RT-RPA）在37～42℃恒温下完成扩增，无需精准的温度控制，可在20～40 min内达到检测水平，方法操作简单、不受仪器限制，特异性和灵敏度均较为优异，近年来在现场快检领域备受关注。冯黎霞等^[33]根据MCMV CP基因序列设计1对特异性引物，构建了两步法RT-RPA检测体系，该方法特异性良好，40℃条件下反应40 min完成扩增，可检测到浓度稀释到10^-4的玉米叶片样品cDNA，灵敏度与常规RT-PCR相当。Jiao等^[34]等基于CP基因序列建立了MCMV的两步法RT-RPA检测体系，仅需在38℃恒温下扩增30 min，对SCMV、RBSDV和PenMV无交叉反应，对感染MCMV的叶片样品总RNA的灵敏度为2.3×10^-6 μg/反应，是常规RT-PCR的10倍，对6份田间玉米叶片样品检出3份MCMV阳性，与常规RT-PCR检测结果一致。上述建立的MCMV的RT-RPA方法虽然简便了操作程序，但是两步法需要经过逆转录反应合成cDNA模板、凝胶电泳等步骤，不利于田间现场快速检测。

2.3 反转录重组酶介导的等温扩增（RT-RAA）方法

反转录重组酶介导的等温扩增（reverse transcript recombinase-aided amplification，RT-RAA）方法的反应原理与RT-RPA方法相似，区别在于反应体系中的关键酶和蛋白不同。邝瑞瑞等^[35]等针对MCMV CP基因序列设计特异性引物和探针，与侧流层析试纸条（lateral flow assay，LFA）结合建立了一种RT-RAA快速检测方法，该方法在37℃恒温下反应8 min，将胶体金试纸条插入到反应液中，通过观察试纸条条带颜色变化读取检测结果，整个检测过程最短仅需13 min，对MCMV阳性样品RNA和质粒DNA的检测灵敏度分别为8.6×10^-6 ng/μL和92.5 拷贝数/μL，均是常规RT-PCR的10倍。此外，该方法还可通过读取试纸条的阳性质控条带的颜色变化来排除假阴性，操作简单、特异性强、灵敏度高，适用于田间、现场快速检测。但该方法需打开反应管插入试纸条进行反应，易出现气溶胶污染造成假阳性结果，其稳定性有待进一步验证。

3 CRISPR/Cas系统

基于成簇规律间隔的短回文重复序列及其关联蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins system，CRISPR/Cas）系统能识别特定核苷酸序列能力，并具有附属核酸切割活性原理，CRISPR/Cas技术在基因编辑、疾病治疗和诊断中具有广阔的前景，也是当前植物病害诊断中较为热门的方向之一^[36]。Duan等^[37]将CRISPR/Cas12a系统和RT-RAA技术相结合，建立了一种MCMV的核酸检测视觉识别方法，该方法针对CP基因序列为检测靶标在37℃恒温条件下进行RT-RAA反应15 min，随后将反应液加入含有单链DNA 探针CRISPR/Cas12a系统中，阳性靶标会激活Cas12a的单链DNA核酸内切酶活性，裂解单链DNA探针而产生荧光信号，可在440～460 nm的蓝光下产生肉眼可见的检测结果。该方法与RBSDV、SCMV、雀麦花叶病毒（brome mosaic virus，BMV）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）和番茄褪绿病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）等病毒无交叉反应，对10倍梯度稀释cDNA的检测灵敏度为10^-5，是常规RT-PCR的1000倍。

4 高通量测序（NGS）方法

高通量测序（next-generation sequencing，NGS）方法不需要预知病毒的染病特征和靶向扩增序列，短时间内可获得病毒基因组序列，结合生物信息学分析可同时鉴定已知或未知的病毒，并可以将病毒鉴定到种甚至株系，因此，NGS方法已成为植物病毒检测和鉴定的一种强大技术手段。Adams等^[27]运用Roche 454测序平台和生物信息学分析，获得肯尼亚MCMV分离物全基因组序列，并证实肯尼亚玉米MLN由MCMV和SCMV复合侵染引起。Wamaitha等^[38]从肯尼亚16个县收集疑似MLN样品共68份，利用Illumina测序平台进行宏基因组测序分析，发现肯尼亚MLN由MCMV、SCMV和玉米线条病毒（maize streak virus，MSV）等共同侵染引起，揭示了肯尼亚MLN及其相关病毒在肯尼亚的地理分布、进化关系及病害流行的复杂性。Adams等^[9]首次在卢旺达玉米中鉴定出MCMV，通过基因组序列及进化关系分析证实：卢旺达MCMV分离物与肯尼亚分离物基因组序列相似度高达99%，推测两地区发现的MCMV有相同的起源。此后，Asiimwe等^[39]从卢旺达主要玉米产区收集疑似样品576份，混合后利用Illumina测序平台进行基因组测序分析，结果表明，卢旺达MLN主要由MCMV和SCMV共同侵染引起，并明确了MLN相关病毒在卢旺达的具体分布情况。

5 总结与展望

本文综述的检测方法各有优缺点，可根据不同情况选择合适的方法进行MCMV检测。常规RT-PCR和实时荧光RT-PCR方法是当前实验室检测的“金标准”，但需要配备相应仪器设备，对操作技术和环境要求也较高，可作为实验室精准检测、鉴定和复核的主要手段；而RT-LAMP、RT-RPA、RT-RAA和CRISPR/Cas系统等方法克服了需要昂贵的设备仪器等缺点，操作简单、快速，特异性强、灵敏度高，且结合荧光试剂或试纸条可实现可视化观察检测结果，在田间、现场快速检测中具有较好的应用前景，但存在仍需前端核酸提取步骤、易出现交叉污染和检测成本过高等问题，目前仍以技术开发为主，尚未实现规模化市场应用；NGS方法则受限于检测时间和使用成本，无法用于大规模的样品筛查，但在研究病毒复合侵染、作用机制及进化溯源等方面有着独特的优势。考虑到MCMV感染样品的复杂性和病毒的高度变异性，建议对可疑样品采取两种以上的方法进行复核验证。

此外，目前已有一些新型检测方法也被开发和运用到植物病毒检测中，如金纳米粒子比色探针、表面等离子共振生物传感器、微流控芯片、单分子检测和数字PCR等，其在检测时间、高通量、自动化和智能化等方面具有独特优势，但是这些新型检测方法仅处于实验室探索阶段，其稳定性和实用性尚待进一步提高。随着检测技术的发展，MCMV的检测方法也将朝着快速、精准、便捷、高通量和智能化等方向发展，一些新型检测方法也有望在将来成为新的主流检测方法。

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