林萍萍 史云鹏 安鹏天 张鹏翔

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染引起，临床上以猪只呕吐、水样腹泻、脱水等为主要症状，7日龄内的哺乳仔猪感染率最高，死亡率为80%～100%。猪流行性腹泻在世界范围内广泛流行，尤以亚洲最为严重，感染频率一直大幅上涨。就我国而言，2010年曾出现G1b亚型PEDV变异毒株，导致PED大规模暴发流行，大量仔猪感染死亡，给养猪业带来巨大经济损失。《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》把PED列入其他传染病、寄生虫病中，新版《一、二、三类动物疫病病种名录》将其列为二类动物疫病。当前，快速准确的诊断是PED防控的关键点，因此本文重点综述了检测方法的研究进展，以期为猪流行性腹泻的防控提供参考。

1 PED流行概况

1.1 病原学

PEDV属于尼多病毒目、冠状病毒科、α-冠状病毒属的一种，与传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道冠状病毒等同属。该病毒是有囊膜的单股正链RNA病毒，形态略呈球形，直径大小为95～190 nm，囊膜上有花瓣样状纤突，由核心向四周放射，是典型的冠状病毒形态^[1]。PEDV的基因组约为28 kb，具有纤突糖蛋白（S）、核衣壳蛋白（N）、小膜蛋白（E）、囊膜蛋白（M）4种结构蛋白，16种非结构（即NSP1-NSP16）蛋白和辅助蛋白ORF3^[2]。PEDV基因组中高变区主要位于S、N、ORF3和NSP2基因，其中较为保守的M^[3]和ORF3基因常被用来作为分子诊断的主要依据。S基因易变异和重组，导致其在不同毒株间差异较大，所以S基因可用于PEDV毒株的鉴别诊断和流行病学监测^[4]。S、N^[5]和M^[6]蛋白作为主要膜蛋白，常作为PEDV诊断靶蛋白和疫苗开发的候选蛋白。ORF3蛋白是由ORF3基因编码的PEDV唯一辅助蛋白，其与毒力强弱有关，可用于PEDV强弱毒株的鉴定^[7]。

1.2 PEDV的特性

PEDV在高温下耐受力低，抵抗力弱，56℃下50 min或65℃下10 min即可被完全灭活。对多种消毒剂、光照较为敏感，如氢氧化钠、季胺盐类等消毒剂能够使其灭活。病毒能在粪水中存活9个月，可在4℃条件下存活至少28 d，随着温度上升，存活时间逐渐缩短。虽然PEDV对温度比较敏感，但超声或者反复冻融处理不影响其病毒毒力。

1.3 PED的流行特点

PEDV只感染猪，不同品种和各个生长阶段的猪都能感染发病，但不同生长阶段猪的死亡率不同，哺乳仔猪的死亡率最高。冬季、春季是PEDV感染的高发季节，其中当年的11月到次年2月发病率最高，尤其是在温度突然变化的情况下更易暴发。发病猪和带毒猪是主要的传染源，PEDV有多种传播途径，主要通过粪-口传播，另一种传播途径是经粪便-鼻腔的空气传播，在哺乳猪中具有传染性^[8]。此外，PEDV也可通过乳汁和精液进行传播。最新研究报道阳性母猪产下仔猪的睾丸和脐带中存在PEDV，首次证实了PEDV可经胎盘传播^[9]。

1.4 PED国内流行现状

我国于1973年首次出现PED的报道，并于1980年首次分离得到PEDV，之后多地均有PED发生的报道。2010年之前，由于PEDV灭活疫苗和弱毒疫苗的广泛使用，PED在我国得到基本控制。但2010年末，不少猪场相继出现了具有较高毒力的PEDV变异株^[10]，PEDV变异株可引起严重腹泻且具有高发病率和高死亡率。PEDV目前只有一个血清型，根据PEDV的S基因编码的氨基酸N端的不同，PEDV被分为两大基因群，G1型（G1a、G1b）和G2型（G2a、G2b、G2c）。G1型是以CV777、DRl3、SD-M等株为主的经典毒株，G2型为变异毒株，其中G1b为低致病力变异毒株，G2a、G2b为高致病力变异毒株。近年来，国内研究人员对不同地区的PEDV进行了分子流行病学调查，PEDV感染在山东、江苏、河北、四川以及华中地区和河南部分地区普遍存在，在猪腹泻病毒病中PEDV阳性率占比较大，且PEDV变异株基因组的变异速率加快^[11]，研究表明，2017—2021年我国流行的主要PEDV毒株为G2c亚型毒株^[12]。目前，PEDV是猪场腹泻发病的主要病原^[13]。

2 PED检测技术

2.1 病原学检测技术

2.1.1 病毒的分离与鉴定

病毒的分离鉴定是病原学检测中最经典的技术，是PED确诊的重要依据。目前分离和增殖PEDV使用最多的是Vero（非洲绿猴肾）细胞系，细胞培养时加入外源性胰蛋白酶有利于PEDV增殖。此外，培养PEDV的细胞还有PK、CPK、MAl04、PK-15、ESX等^[14]，其中常用的是PK-15细胞。采集出现腹泻24 h内小猪的空肠及肠内容物经处理后接种Vero细胞，37℃ CO₂培养箱中培养3～4 d，观察是否出现典型的细胞病变，细胞融合、合胞体形成和细胞脱落等特征，成功分离后通过免疫荧光、RT-PCR等方法鉴定。该方法虽然能准确诊断PEDV，但检测周期长且操作繁杂，不适合病原的快速诊断。

2.1.2 免疫电镜法

电镜法采用电子显微镜来观察病毒的结构、形态特征等，实现对病原的有效诊断。由于PEDV与TGEV形态特征相似，普通电镜难以区分鉴别。而免疫电镜法（immunoelectron microscopy，IEM）结合了免疫化学技术与电镜技术，可以更准确地区分TGEV和PEDV^[15]。IEM虽然具有敏感性高、特异性强、定性准确等优点，但需要较为精密的电镜设备，且在病料处理过程中纤突蛋白容易脱落，失去典型形态，一般需3～7 d才能出具检测报告，易导致PED传播，不适用于大规模临床诊断。

2.2 血清学检测技术

2.2.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosor-bent assay，ELISA）是检测病毒的标准方法，其具有简便、快速、灵敏性高、特异性强、可批量检测样品等优点。该方法可从粪样和血清中检测PEDV抗原，还可以特异性地检测黏膜免疫产生的IgA的抗体水平。目前我国检测PEDV抗体大多采用国外进口的IDVET间接ELISA试剂盒，虽然特异性强，准确度高，但其价格昂贵，不适合应用于基层大批量的检测。近年来，国内外已有很多用于PEDV检测的ELISA方法的研究报道，主要有间接ELISA、竞争ELISA、双抗体夹心ELISA等方法。

间接ELISA主要是选用灭活的全病毒或纯化后的原核表达重组蛋白作为包被抗原，其中S2、N蛋白高度保守，常作为包被抗原。全病毒抗原包被的间接ELISA检测PEDV敏感性高于结构蛋白包被的间接ELISA^[16]。谷长维等^[17]建立了以Vero细胞培养全病毒抗原（LNCT2株）间接ELISA方法，结果显示TGEV、猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）抗体无交叉反应，灵敏度和特异性分别为92.6%和90.1%，可作为PEDV感染的可靠检测方法。牟一娇等^[18]建立了基于全长S2蛋白的IgA抗体ELISA新型检测方法，可有效检测血清和猪口腔黏液类型样本，与IDEXX IgA抗体检测试剂盒的符合率为90.77%，该方法对PEDV的临床诊断及疫苗免疫效果评估具有重要的临床实践意义。

竞争ELISA是基于PEDV单克隆或多克隆抗体的血清学检测方法，当待检样品无法提纯或不能进行稀释时，可用此法检测PEDV特异性抗体。万颖等^[19]基于N蛋白建立了竞争ELISA法，结果表明其敏感性和特异性与进口IDVET ELISA商品试剂盒的相近，可用于PEDV的流行病学调查和抗体水平的监测。

双抗体夹心ELISA方法一般是以两种针对不同抗原表位的PEDV特异性抗体建立的，其检测的特异性和灵敏性显著提高。马宇聪等^[20]建立了以纯化的家兔抗猪流行性腹泻病毒多隆抗体为捕获抗体，以鼠抗PEDV单克隆抗体标记HRP为检测抗体的双抗体夹心ELISA法，最低检测量为3.125×10³ TCID₅₀/mL，该方法特异性强、灵敏度高，适用于猪粪便的PEDV检测。

2.2.2 胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术（immune colloidal gold technique，GICA）具有操作简单、无需昂贵的精密仪器、检测时间短、易于观察、适用于基层和养殖场使用等优点，目前已成为一种成熟的快速检测方法。但该方法仍存在一定不足，如不能进行定量检测，敏感性和特异性低等。蔡杰等^[21]建立了以荧光微球作为标记载体，快速检测PEDV的免疫荧光层析方法，该方法最低检出限为50 TCID₅₀/mL，敏感性和特异性分别为97.3%和98.7%，可考虑替代RT-PCR用于PEDV的临床辅助诊断。

2.2.3 荧光免疫层析检测技术

荧光免疫层析技术（fluorescence immunochromatography assay，FICA）由免疫层析技术与色谱技术相结合，是在原有胶体金免疫基础上发展而来的一种提高检测性能的新技术。王华俊等^[22]建立了一种检测PEDV的荧光时间分辨荧光免疫方法（time resolved fluorescence immunoassay，TRFIA），该方法可以实现对PEDV的定量检测，适合基层检测，为PED的鉴别诊断提供了新方法。随着新技术的发展，不断催生的新型免疫层析技术将朝着定量、高灵敏度、多标记物的方向发展。

2.2.4 均相光激化学发光免疫分析技术

均相光激化学发光免疫分析技术（amplified luminescent proximity homogeneous assay linked immunosorbent assay，AlphaLISA）是一种新型的PEDV抗体检测技术。研究者用该方法检测了不同条件下猪体内PEDV IgA和IgG的抗体水平，结果表明感染PED后第二周可检测到这两种抗体。AlphaLISA具有敏感性更高、速度更快、操作简单、样本需求少等优点^[23]。

2.3 分子生物学检测技术

2.3.1 反转录-聚合酶链反应

反转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）具有灵敏性较高、检测时间短和批量检测临床样本等优势，是PEDV检测技术应用最广泛的一种。随着技术不断革新和改进，研究者报道了套式RT-PCR和可同时检测PEDV与常见猪肠道病毒的多重RT-PCR方法，如石坚等^[24]通过S基因遗传变异分析设计出的套式RT-PCR方法，可以快速鉴定是否为变异毒株，检测灵敏度比常规PCR高2个数量级，提高了检测效率，减少了检测费用。辛忠昊等^[11]建立了可同时检测PEDV、TGEV、猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）和猪轮状病毒（porcine rotavirus，PoRV）的四重RT-PCR方法，结果表明与TGEV、PDCoV和PoRV均无交叉反应，且敏感性高，检测下限为10² copies/μL，为4种病毒病的鉴别诊断提供技术手段。

2.3.2 实时荧光定量RT-PCR

实时荧光定量RT-PCR（real-time RT-PCR，RT-qPCR）技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针，通过实时监测荧光强度实现对病毒核酸扩增的定量检测，该方法具有高敏感性和特异性，可以检测组织、环境等样品，既能定性也能定量。苏金辉等^[25]将PEDV的N基因和S基因作为靶基因设计特异性引物和探针，建立了检测PEDV经典毒株与变异毒株的TaqMan双重荧光定量PCR方法，结果表明与猪场常见疫病病原体均无交叉反应，具有较高的灵敏性，对N基因和S基因的检测下限分别为1 copies/μL和10 copies/μL，且能在1 h内完成检测和毒株分型，对PED风险预警及毒株分型具有重要意义。冉伟等^[26]基于PEDV ORF3基因序列建立了SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法，结果证实该方法比RT-PCR敏感100倍，与TGEV、PoRV、PDCoV和PRRSV无交叉反应，可为PEDV的快速、定量检测提供技术手段。

2.3.3 纳米RT-PCR

纳米RT-PCR作为一种新型PCR方法，灵敏度及特异性高于普通PCR，不需要精密的仪器设备，成本较低，可用于PEDV检测。付琦媛等^[27]基于PEDV的S基因设计引物，建立了可以区分经典与变异PEDV毒株的双重纳米RT-PCR法，结果证明该方法能特异性鉴别经典和变异PEDV毒株，且灵敏度比之前的研究有所提高，可应用于PED的流行病学调查、快速检测。

2.3.4 逆转录-环介导等温核酸扩增技术

逆转录-环介导等温核酸扩增技术（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）是采用靶基因上的6～8个区域设计4～6种引物及链置换型的Bst DNA聚合酶进行扩增反应。该技术与传统RT-PCR相比，具有可视化、操作简单、检测时间短且不需要特殊设备等特点，非常适合基层、猪场防控的检测。狄亚心等^[28]以PEDV N基因的保守序列为靶基因设计引物建立了基于RT-LAMP的PEDV快速检测方法，该方法能够检测出的最低RNA浓度为6.52×10^-5 mg/L，敏感度是常规RT-PCR的100倍，具有良好的特异性和重复性，使用便捷，适用于流动性和持续性PEDV感染的监测。

2.3.5 逆转录-酶促恒温扩增技术

逆转录-酶促恒温扩增技术（reverse transcrip tion-Enzymatic Recombinase Amplifica-tion，RT-ERA）是一种新研发的等温核酸扩增技术，其原理是在37～42℃恒温条件下，将微量RNA的特异性区段在数分钟内扩增数十亿倍。检测时间及仪器限制方面都比RT-PCR更具优势。Yang等^[29]将逆转录-酶促恒温扩增技术与CRISPR-Cas12a系统相结合，建立了一种基于Cas12a/crRNA的可视化、简单、可靠的核酸检测方法，可鉴定PEDV经典减毒疫苗株和野生型毒株，与其他猪病原体无交叉反应性，特异性与qPCR相媲美，并且适用于临床检测，实现了对PEDV的现场准确快速核酸检测。

3 结语

PED是影响全球养猪业发展的重大疾病之一，在我国感染范围广泛，PEDV防控存在临床诊断不够准确、疫苗免疫效果不理想等问题，因此鉴别诊断及免疫后的血清抗体效价评估对于控制猪流行性腹泻至关重要，特别是对跨省调运生猪、猪肉贸易中的风险识别与口岸监测筛查而言，选择合适的检测方法，是降低病毒传播风险的关键点。目前已有多种PED检测方法，每种方法都有其自身优势及局限性，病毒学方法可以快速鉴定PEDV并与其他猪肠道病原区分开；ELISA等血清学方法检测成本低，且简便、快速、准确，已被广泛用于病毒监测及评价疫苗免疫的有效性；RT-PCR、荧光定量RT-PCR等分子生物学方法是PEDV感染的首选方法，可对临床样品中的病毒进行敏感、特异、快速检测，广泛用于PED暴发期间、检疫或屠宰猪的检测。实际工作中，应根据试验条件及检测目的差异，选择合适的检测方法或者综合上述方法，最大限度提高PED检测准确性，实现及时预警，有效防控PED流行和暴发。随着免疫学和分子生物学技术的不断发展，相信会有越来越多简便、快速、灵敏、低成本、高通量的检测方法应用于PED的监测检测，进一步为PED精准防控提供更好的技术支撑。

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第一作者：林萍萍（1987—），女，汉族，河北沧州人，硕士，兽医师，主要从事进出境动物疫病检疫研究，E-mail: weichen-lin@163.com

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