曹丹 洪灯 黄炜 朱倩 应慧 肖道清

Abstract A solid phase extraction-high performance liquid chromatography method for the determination of three cannabinoids in cosmetics was established. The sample was extracted with methanol or acetonitrile saturated n-hexane/n-hexane saturated acetonitrile, purified by solid phase extraction, separated by a C₁₈ chromatography column, and determined by a diode array detector with quantification by an external standard method. The results showed that the method had a linear correlation coefficient (r²) greater than 0.9994 in the concentration range of 0.1-5.0 mg/L, and the quantitative limit was 5 mg/kg. Spiked recovery tests at three concentration levels with the limit of quantification of 1, 2, and 10 times were performed on different matrices. The recoveries of three cannabinoids were 86.4%-108.0%, and the relative standard deviation was no more than 4.83% (n = 6). This method is easy to operate, has high sensitivity, fast detection speed, strong applicability, and can be used as a rapid quantitative analysis method for the content of cannabinoids in cosmetics.

Keywords cosmetics; cannabinoid; solid phase extraction (SPE); high performance liquid chromatography (HPLC)

工业大麻是指Δ9-四氢大麻酚（Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC）含量低于0.3%的大麻，其提取物因具有抗炎、抗菌、抗氧化、调节油脂分泌等作用而被应用于化妆品中^[1-4]。大麻提取物中具有代表性的大麻素主要有大麻二酚（cannabidion，CBD）、大麻酚（cannabinol，CBN）、Δ9-四氢大麻酚。其中，CBD是工业大麻中含量最丰富的大麻素，也是主要药用功效成分之一；Δ9-THC是具有精神活性的物质，具有致幻成瘾作用；CBN是一种让人精神愉悦的大麻素。在加拿大、美国（部分州）、泰国、乌拉圭及欧盟部分成员国等国家和地区，大麻的使用是合法的。我国国家药监局于2021年5月28日发布的第74号公告中明确将大麻仁果、大麻籽油、大麻叶提取物列为化妆品禁用植物原料，将大麻二酚列为化妆品禁用原料，明确禁止大麻成分用于化妆品中^[6]。由于世界各国对大麻的使用监管要求不一，因此，研究化妆品中大麻二酚（CBD）、大麻酚（CBN）、Δ9-四氢大麻酚等大麻素的检测技术和方法，对发现和控制化妆品中添加大麻提取物和大麻素类物质具有现实意义。

目前已报道的关于大麻素类物质检测方法的研究主要是针对尿液、血液、毛发等生物样本和大麻植物本身^[7]，而就化妆品中多种大麻素含量同时测定的研究较少^[8-10]，少数研究中仅采用高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）^[11]和液相色谱-质谱/质谱联用（Liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法^[12]。而HPLC-MS/MS法对设备和操作者要求较高，已有的HPLC法文献前处理过程单一，基质覆盖不够全面，未对不同化妆品基质采用不同的前处理方式进行优化和讨论。本研究充分考虑了多种复杂基质的化妆品，通过优化和比对不同的提取和净化等条件，建立了用固相萃取-液相色谱法检测油类、乳霜、唇膏、面膜、粉类等多种基质化妆品中的大麻二酚（CBD）、大麻酚（CBN）、Δ9-四氢大麻酚含量的技术方法，以期为加强化妆品安全监管提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

LC-UItimate3000高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；色谱柱C₁₈（5 μm，4.6 mm×150 mm），月旭科技；色谱柱Phenyl-Ether（5 μm，4.6 mm×150 mm），月旭科技；XS-205电子天平，瑞士梅特勒公司。

1.2 材料

甲醇（色谱纯），西班牙Scharlau（萨劳）；正己烷（色谱纯），麦克林；乙腈（色谱纯），霍尼韦尔；Δ9-四氢大麻酚标准溶液（CAS:1972-08-3，100 mg/L），天津阿尔塔科技有限公司；大麻二酚标准溶液（CAS:13956-29-1，100 mg/L），天津阿尔塔科技有限公司；大麻酚标准溶液（CAS: 521-35-7，100 mg/L），天津阿尔塔科技有限公司；固相萃取柱，N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物（Balanced Reverse Polymer，BRP），200 mg/6 mL，月旭科技；面膜、乳霜、唇膏、粉类、油类等化妆品，均为市售。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

准确称取油类、乳霜、唇膏等化妆品试样0.4 g（精确至0.001 g），置于50 mL离心管中，加入5 mL乙腈饱和的正己烷涡旋混匀，再加入5 mL正己烷饱和的乙腈，涡旋混匀，超声提取10 min，以6000 r/min 离心5 min，取下层乙腈层；正己烷层再次加入5 mL正己烷饱和的乙腈重复提取一遍，合并乙腈层，待净化。乙腈层全部过BRP柱，再用2 mL甲醇洗脱，收集过柱后的所有溶液，氮吹浓缩至约0.5 mL，再用甲醇定容到10 mL，用0.22 μm有机相滤膜过滤，滤液待液相色谱分析。

准确称取面膜、粉类化妆品试样0.4 g（精确至0.001 g），置于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋混匀，超声提取10 min，以6000 r/min离心5 min，上清液全部过BRP柱，再用2 mL甲醇洗脱，收集过柱后的所有溶液，氮吹浓缩，再用甲醇定容到10 mL，用0.22 μm有机相滤膜过滤，滤液待液相色谱分析。

1.4 色谱条件

色谱柱：C₁₈色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱温30℃，进样量10 μL， 0.015 mol/L磷酸二氢钠缓冲液（pH = 4.0）︰乙腈= 30︰70（体积比）为流动相洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长：210 nm，时间：30 min。此种色谱条件下，3种组分分离良好，色谱图如图1所示。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

本方法分别选取色谱柱C₁₈（5 μm，4.6 mm×150 mm）和Phenyl-Ether（5 μm，4.6 mm×150 mm）对3种大麻素的分离情况进行分析比较，试验结果表明，使用Phenyl-Ether色谱柱进行色谱分离时，Δ9-THC、CBN 2个目标物较难分离，尝试不同梯度的梯度法洗脱也无法达到理想的分离度，并且使用Phenyl-Ether色谱柱3个目标物的出峰时间早；使用C₁₈色谱柱时，Δ9-THC、CBD、CBN 3种化合物的响应值、保留时间以及分离度较好。因此本方法选择C₁₈色谱柱作为液相色谱柱。

2.2 吸收波长的选择

采用二极管阵列检测器进行全波段扫描，可以发现Δ9-THC、CBD的最大吸收波长在210 nm附近，CBN的最大吸收波长在220 nm附近。考察Δ9-THC、CBD、CBN 3种目标物分别在吸收波长为200 nm、210 nm、220 nm时的响应值，结果表明，Δ9-THC、CBD、CBN 3种目标物吸收波长分别为210 nm、210 nm、220 nm时响应值最高。考虑到同时分析3种目标物的需要，且CBN在210 nm和220 nm下的响应值差别不大，因此本方法选择210 nm作为检测波长。

2.3 流动相的选择

本方法对流动相的组成进行了考察，选取甲醇和乙腈作为有机相进行比较，结果显示，用甲醇作为有机相时，3种目标物没有出峰；乙腈体系下，3种目标物的分离度和响应值都较好，因此选择乙腈作为有机相。

本方法也对水相流动相进行了考察优化，分别使用水、0.015 mol/L磷酸二氢钠缓冲液（pH = 4.0）作为水相进行对照。结果显示，在0.015 mol/L磷酸二氢钠缓冲液（pH = 4.0）作为水相条件下，各目标物分离度好且有更高的信号响应，有机相和水相的比例为7︰3。进一步使用等度和不同梯度洗脱进行比较，3种大麻素的信号响应差异不大，故选择操作较为方便的等度洗脱。因此，本方法选择0.015 mol/L磷酸二氢钠缓冲液（pH = 4.0）︰乙腈= 30︰70（体积比）为流动相进行等度洗脱。

2.4 提取溶剂的选择

选取甲醇、乙腈饱和的正己烷/正己烷饱和的乙腈这两种提取溶剂，在油类、乳霜、唇膏、面膜和粉类5类化妆品中各选取一款含有Δ9-THC、CBD、CBN的样品进行提取，用峰面积比较不同提取溶剂的效果，结果如图2所示。根据试验结果，对于粉类和面膜基质化妆品，甲醇作为提取液提取效果优于乙腈饱和的正己烷/正己烷饱和的乙腈，对于其他3种基质，将乙腈饱和的正己烷/正己烷饱和的乙腈作为提取溶剂提取，效率明显高于甲醇。因此，对于油、乳霜、唇膏等化妆品样品，采用乙腈饱和的正己烷/正己烷饱和的乙腈进行提取，而对于粉类和面膜样品，则采用甲醇进行提取。

2.5 提取方式的比较

在确定了提取溶剂的基础上，本方法继续用油、乳霜、唇膏、粉类和面膜样品比较涡旋法、均质法和超声法的提取效果，结果表明，在相同的提取时间下，超声提取的效率优于涡旋振荡和均质提取。继续对超声提取的时间进行优化，结果显示，超声时间为10 min时，3种大麻素的峰面积较超声时间为5 min时明显增加，与超声时间为20 min时基本持平。如图3所示。

2.6 净化柱的选择

选择3款净化柱，分别是中性氧化铝（Alumina-N）柱、去磷脂小柱、BRP柱。采用空白样品加标的方式，比较了3种净化柱，分别对油类、唇膏、面膜、乳霜、粉类5种类型化妆品样品的净化效果进行比较，具体结果如下。

经分析5种空白样品基质的色谱图，油和面膜阴性样品在CBN的出峰位置有干扰，唇膏阴性样品在CBD的出峰位置有干扰，乳霜和粉类阴性样品对3种目标物的出锋没有干扰。试验表明，BRP柱和中性氧化铝（Alumina-N）柱对油、面膜和唇膏样品的净化效果较好，能消除各基质在目标物出峰位置的干扰。进一步开展加标回收率的分析，发现BRP柱净化效果较好，5种不同基质中3个目标物质的回收率均在80%～110%之间。5种样品空白基质图和样品加标图如图4和图5所示。

2.7 线性方程和定量限

取各标准品溶液，用甲醇稀释得到0.1～5.0 mg/L标准工作溶液并进行测定，以峰面积为纵坐标y，标准工作溶液的质量浓度为横坐标x绘制标准曲线。选取不含大麻素成分的油类、乳液、面膜、粉类、唇膏空白样品，添加不同浓度标准样品以确定不同基质的方法定量限。以10倍信噪比确定定量限，根据信噪比计算结果，部分基质样品的定量限可能更低，综合考虑操作的便捷性，基于最不灵敏的化合物的定量限，将5种基质中3种不同大麻素的定量限进行了统一，定量限均为5 mg/kg。见表1。

2.8 基质效应

本方法对各种基质进行了基质效应考察，使用甲醇配制的标准曲线斜率（Slope A）和用空白基质配制的相同浓度标准曲线斜率（Slope B）进行比较，按基质效应（ME）＝（Slope B－Slope A）/Slope A×100%的计算公式，结果如图6所示。根据基质效应的判断标准，所有基质的|ME|均小于20%，为弱基质效应。

2.9 回收率与精密度

以1倍定量限、2倍定量限和10倍定量限为添加浓度进行3个水平6次平行的加标回收试验。3种目标物在不同基质样品中的加标回收率为86.4%～108.0%，精密度不超过4.83%。

2.10 样品测定结果

2021年1—2月在各电商平台购买了包装或网页宣传的添加了大麻提取物或者以CBD为特色的产品。其中，购买的CBD油经检测，CBD含量为标称值的101%，Δ9-THC有检出，但含量未超出0.3%；购买的粉底液、乳液、面霜、面膜和唇膏等样品，均检出CBD，含量在24～94 mg/kg之间；CBN均未检出。

表3 样品测试结果

Table 3 Results of sample testing

3 结论

本文建立了适用于油类、面膜、乳霜、粉类、唇膏等不同基质中的Δ9-四氢大麻酚、大麻二酚、大麻酚的检测方法，能覆盖使用大麻提取物原料的主要化妆品类型。通过不同的提取方式结合固相萃取净化方法，降低样品中的基质和杂质干扰，目标化合物的回收率和精密度更高。方法定量限为5 mg/kg。对不同基质进行加标回收试验，3种大麻素的回收率为86.4%～108.0%，相对标准偏差不超过4.83%。试验结果表明，该方法操作简便、灵敏度高、精密度好，定量限满足国内外对化妆品中大麻素的限量要求^[13]，可作为化妆品中大麻素含量的快速定量分析方法。

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图1 3种大麻素液相色谱图

Fig.1 Liquid chromatograms of three cannabinoids

图2 不同提取溶剂对油、乳霜、唇膏、面膜和粉类化妆品基质提取效果比较

Fig.2 Comparison of the effects of extraction solvents on the extraction of five cosmetic substrates of oil, cream, lip cream, mask and powder

(a)

(b)

图3 不同提取方式（a）、不同超声时间（b）对油类、乳霜、唇膏、面膜、粉类的提取效果比较

Fig.3 Comparative of extraction effects of oils, cream, lip cream, masks and powders by different extraction methods (a) and different ultrasonic times (b)

图4 空白样品基质色谱图

Fig.4 Chromatograms of blank sample matrix

图5 样品加标色谱图

Fig.5 Chromatograms of spiked samples

表1 3种大麻素的线性方程、相关系数和定量限

Table 1 Linear equation, correlation coefficient, and limit of quantitation for three cannabinoids

图6 不同样品的基质效应情况

Fig.6 Matrix effects of different samples

表2 加标回收和精密度试验结果

Table 2 Results of spiked recovery and precision experiments

第一作者：于趁（1981—），女，汉族，河北石家庄人，硕士，副高级工程师，主要从事食品及化工品分析工作，E-mail: yuky668@126.com

通信作者：艾连峰（1980—），男，汉族，河北唐山人，博士，研究员，主要从事食品分析工作，E-mail: ai_lianfeng@126.com.

1. 石家庄海关技术中心 石家庄 050051

1. Shijiazhuang Customs Technology Center, Shijiazhuang 050051