于趁 甄建辉 项佳林 姚春毅 艾连峰

Abstract A method for the determination of tiamulin and valnemulin in herbal preparations for veterinary purposes was established by solid phase extraction-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The samples were extracted with acetonitrile and purified by MCX solid phase extraction column. The mobile phase gradient elution of acetonitrile and 0.1% formic acid was carried out on a C₁₈ column. The quantitative analysis was performed by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The results showed that the two compounds had a good linear relationship in the range of 1.0-100 ng/mL, and the correlation coefficient (R²) was greater than 0.999. The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of the method were 0.05 mg/kg and 0.1 mg/kg respectively. The recoveries of all the compounds were in the range of 82.0%-106.5% at three supplemental levels (0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg and 1.0 mg/kg), and the precision was in the range of 2.89%-8.95%. The method was simple and accurate, and can realize the determination of two target compounds in veterinary chinese medicine preparations.

Keywords tiamulin; valnemulin; MCX; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; chinese medicine preparations for veterinary purposes

沃尼妙林（Valnemulin）和泰妙菌素（Tiamulin）均属于新一代截短侧耳素类半合成抗生素^[1-2]，在实际应用中，通常用到的是沃尼妙林的盐酸盐和泰妙菌素的延胡索酸盐。沃尼妙林和泰妙菌素均具有广谱抗菌性，该类抗生素通过抑制菌体蛋白的合成对革兰氏阳性菌及支原体起抗菌作用^[3-6] ，可以有效杀灭各种细菌、链球菌以及支原体，具有抗菌活性强、治疗效果显著、休药期短和使用安全性高等特点^[7]。目前被广泛用于猪痢疾、回肠炎、大肠炎及肺炎的治疗及预防，且仅作为畜禽类用药。

作为两种典型的兽用抗生素，沃尼妙林和泰妙菌素在发挥其功效的同时也不可避免地带来了兽药残留的负面影响和危害：1）抗生素对动物的危害主要表现在其对动物自身免疫力的破坏上，大量抗生素进入动物体内后，可打破动物体内正常菌群平衡，引起菌群失调，免疫力下降，进而造成各种内源性和外源性细菌的感染，从而危害动物健康，影响动物源性食品的食用安全和畜牧业的发展。2）抗生素残留对人体的危害。动物体内残留的抗生素会随肉、蛋、奶等制品进入人体，虽然沃尼妙林和泰妙菌素毒性较低，但鉴于其通过食物链进入人体的复杂途径及富集效应，应考虑长期暴露的危害。抗生素可破坏人体正常菌落平衡，造成机体代谢的紊乱和一系列不良症状，还可以产生耐药性病原菌，这些耐药菌在人体消化道微环境中长期存在繁殖，又可以通过转化、转座等各种途径将抗药基因传递至致病菌，从而产生各种危害性更大的超级病原菌。因此，许多国家都对此类药物有限量要求。为严格控制抗生素类药物被非法使用，我国农业农村部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定了泰妙菌素和沃尼妙林在动物性食品中的明确限量要求。

目前，国内外对泰妙菌素和沃尼妙林这两种抗生素的检测方法主要有气相色谱法^[8]、高效液相色谱法^[9-12] 和高效液相色谱-串联质谱法^[13-17]等。我国有农业农村部公告第316号-3-2020《饲料中泰妙菌素的测定 高效液相色谱法》、农业农村部公告第197号-2-2019《饲料中盐酸沃尼妙林和泰妙菌素的测定 液相色谱-串联质谱法》、SN/T 4584-2016《出口动物源性食品中沃尼妙林和泰妙菌素残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》和SN/T 4483-2016《出口活鱼泰妙菌素检测技术规范》检测标准方法，而兽用中药制剂中检测方法尚缺乏。因此，本研究旨在建立一种简单、准确的测定兽用中药制剂中泰妙菌素和沃尼妙林残留的方法，以期对加强兽用中药制剂的安全检测与监管，规范兽用中药制剂产业，保证兽用中药质量安全，以及为维护人民群众身体健康提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）（美国安捷伦公司）；离心机：转速不低于4000 r/min（日立公司）；涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）；氮吹仪（北京普立泰仪器有限公司）；固相萃取装置（美国安捷伦公司）；Milli-Q纯化系统（美国Millipore公司）；聚丙烯离心管：50 mL，具塞；天平：感量为0.01 g和0.1 mg；SHIMADZU VP-ODS C₁₈色谱柱（2.0 mm×150 mm，5 μm，岛津公司）；MCX固相萃取柱（60 mg，3 mL，美国Waters公司）。

乙腈、甲醇（色谱纯，Sunrise公司）；甲酸（色谱纯，德国Fluka公司）；水为Milli-Q高纯水。

泰妙菌素和沃尼妙林标准品：纯度大于98%，Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 标准储备液的配制

分别精密称取泰妙菌素和沃尼妙林各10 mg（精确至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成质量浓度均为100 mg/L的标准储备液。

1.2.2 标准工作液的配制

分别准确移取1 mL上述储备液置于100 mL容量瓶中，用乙腈定容并配制成1.0 mg/L的混合标准中间液；根据需要移取适量混合标准中间液，分别用乙腈稀释成质量浓度为1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L的标准工作溶液。

1.3 样品预处理

称取1 g样品（精确至0.01 g）置于50 mL具塞离心管中，加入20 mL乙腈，于涡旋振荡器上涡旋5 min，萃取完毕后，以4000 r/min离心5 min。

MCX固相萃取柱（60 mg，3 mL）用3 mL甲醇活化，3 mL 0.1 %甲酸水平衡。取2 mL上述乙腈提取液过柱，再依次以3 mL 0.1%甲酸水、3 mL甲醇淋洗固相萃取柱，弃去流出液，洗耳球吹干，最后用3 mL 5%氨水-甲醇（V∶V）溶液洗脱，收集洗脱液，40℃氮气吹至近干，加入1 mL乙腈涡旋溶解，溶液过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4 仪器分析条件

色谱条件：C₁₈柱，2.0 mm×150 mm，粒径5 μm；流动相：含0.1%甲酸的水溶液（A相）和乙腈（B相）；进样量：2 μL；梯度洗脱程序：洗脱条件见表1。

质谱条件：电喷雾电离源ESI（+）；采用多反应监测（MRM）模式；喷嘴电压：1500 V ；毛细管电压：4000 V；干燥气温度：500℃；干燥气流速：10 L/min；雾化气压力：0.10 MPa。

2 结果与讨论

2.1 兽药制剂种类的选择

鱼腥草注射液抗炎效果明显，具有清热、解毒、利湿等功效；麻杏石甘颗粒为解表剂，临床常用于治疗感冒、上呼吸道感染、急性支气管炎、肺炎等；双黄连口服液清热解毒，清宣风热，适用于病毒及细菌感染的上呼吸道感染、肺炎、扁桃体炎、咽炎等作用。泰妙菌素、沃尼妙林以及鱼腥草注射液3种兽用中药试剂针对兽体不同部位器官均有抗炎杀菌类功效，其中泰妙菌素和沃尼妙林都是抗生素类药物，可以有效杀灭各种细菌、链球菌以及支原体，广泛用于猪痢疾、回肠炎、大肠炎及肺炎的治疗及预防。由于其消炎杀菌效果好、价格低廉，在畜禽养殖中极有可能被非法添加到具有类似主治功能的兽用中药制剂中，故选择粉剂、合剂、针剂不同类型的3种兽药制剂作为代表来建立泰妙菌素和沃尼妙林非法添加的测定方法。

表1 梯度洗脱条件

Table 1 Gradient elution conditions

2.2 提取条件的选择

兽药制剂中含有大量有机盐和乳化剂，样品制剂用水稀释回收率低，基质效应大。试验先用有机溶剂提取，避免了样品中有机盐分的干扰，得到了较好的回收率。因泰妙菌素和沃尼妙林在丙酮中略溶，几乎不溶于乙烷，实验选取了乙腈、乙酸乙酯、甲醇3种有机溶剂作为提取溶剂。取阴性的粉剂、针剂和合剂样品3份，分别添加浓度为100 μg/kg，对样品中的泰妙菌素和沃尼妙林进行提取，回收率如图1所示。结果发现，甲醇极性强提取杂质较多，给后续净化带来了一定困难，乙酸乙酯对泰妙菌素提取效果较好，但提取沃尼妙林的回收率较低。考虑到兽药制剂含有大量有机盐分和乳化剂，方法采用乙腈提取，既可以盐析，又可以沉淀乳化剂，能在一定程度上减少基质效应，有利于后续的净化过程，对两种待测物也能取得较好的提取回收率。

图1 不同提取溶剂对泰妙菌素和沃尼妙林回收率结果

Fig.1 Recoveries of tiamulin and valnemulin with different extraction solvents

试验对涡旋法与超声提取法进行考察，加入4 mg/kg泰妙菌素和沃尼妙林，结果发现样品经过涡旋与超声提取，提取效果无明显差别，见表2。同时考察涡旋时间，发现样品涡旋5 min足以将添加药物提取完全。因此，从试验效果、提取时间和试验成本等因素综合考虑，最终选择的提取方式为加入20 mL乙腈后涡旋提取5 min。

表2 提取浓度对比图

Table 2 Comparison chart of extraction concentrations

2.3 净化条件的选择

兽药制剂成分复杂，含有大量的有机盐和乳化剂，直接稀释进样会导致化合物灵敏度降低，同时污染仪器。通过样品加标试验，对C₁₈、HLB和MCX 3种不同SPE净化柱进行了比较。3种净化柱对泰妙菌素和沃尼妙林的净化效果如图2所示。结果表明，C₁₈柱对目标物的保留较弱，同时净化效果较差，基质效应明显；HLB净化操作繁琐，耗时较长，有一定的基质效应。强阳离子交换柱（MCX）对泰妙菌素和沃尼妙林具有较好的净化和浓缩作用，净化回收率高达97.5%。因此，本实验采用MCX固相萃取柱，样品前处理简单，净化效果好，基质干扰小。

图2 不同净化柱的净化回收效果

Fig.2 Purification and recovery effect of different purification columns

2.4 色谱条件的优化

2.4.1 色谱柱的选择

泰妙菌素和沃尼妙林均为弱极性碱性化合物，C₁₈柱对碱性化合物保留峰型极佳且高载量。试验比较了SHISEIDO VP-ODS C₁₈（150 mm×2.0 mm，5 μm）、THERMO GOLD（150 mm×2.1 mm，5 μm）和CAPCELL PAK C₁₈AQ（100 mm×2.1 mm，3 μm）的分离效果。考虑到对目标物的保留、峰型、死体积等影响因素，试验发现，SHISEIDO VP-ODS C₁₈（150 mm×2.0 mm，5 μm）分析柱有对化合物保留能力强、重现性好，且在MRM方式下质谱基线检测本底低。因此，本试验选用SHISEIDO VP-ODS C₁₈（150 mm×2.0 mm，5 μm）柱。

2.4.2 色谱条件的优化

在电喷雾质谱中目标物的分离和离子化效率会受到流动相组成的很大影响，从而影响到目标化合物的灵敏度。为了使两种化合物实现有效分离并减少基质干扰，通过在流动相条件中设置梯度洗脱条件来提高定性和定量的准确性。本试验考察了在相同梯度洗脱条件下乙腈-水和甲醇-水两种流动相体系，对泰妙菌素和沃尼妙林的分离度、灵敏度和峰形的影响，结果显示乙腈-水体系能获得较好的分离效果以及仪器响应。另外，考虑到目标物采用的均是正离子模式，考察了在流动相中加入不同浓度甲酸溶液对色谱分离和仪器响应的影响。结果发现，加入0.1%的甲酸后目标物的质谱响应有显著提高，峰形也较好，因此最终选用乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱作为流动相，梯度洗脱条件见表1。

2.5 质谱条件的建立

泰妙菌素和沃尼妙林均属于弱碱性化合物，因此选择正离子模式对目标物进行质谱条件优化。将浓度为100 μg/L的泰妙菌素和沃尼妙林标准溶液以蠕动泵进样方式注入质谱仪中，在m/z 100～800扫面范围内以正离子模式对其进行一级质谱全扫描，以确定目标物分子离子峰，并以此峰为母离子，对离子源参数进行优化，使质谱仪的测定灵敏度达到最高；然后在一定的碰撞能量下对二者的子离子进行全扫描，得到二级质谱，选择丰度强且干扰较少的2对子离子，以MRM正离子模式优化各质谱参数，使样品溶液中的离子化效率和峰形达到最佳。所得离子参数见表3，图3为泰妙菌素和沃尼妙林10 ng/mL混合标准溶液的MRM色谱图。

表3 被测物的参考监测离子对和裂解能量

Table 3 Reference monitoring ion pairs and cracking energy of the measured objects

注: *为定量离子对, 对于不同质谱仪器, 仪器参数可能存在差异, 测定前应将质谱参数优化到最佳.

2.6 基质效应的考察

基质效应是指色谱分离时共洗脱的物质无法改变待测成分的离子化效应，从而引起信号增强或抑制。基质效应明显时会降低方法的灵敏度和影响方法准确性，带来误差，因此液相色谱-串联质谱方法开发和确证过程中需要对基质效应做出评价。基质效应=（基质匹配标准曲线的斜率/纯溶剂标准曲线的斜率）×100%。一般认为，基质效应在85%～115%之间则认为基质效应不明显^[18-21]。

图3 泰妙菌素和沃尼妙林混合标准溶液的MRM色谱图

（10 ng/mL）

Fig.3 MRM chromatogram of mixed standard solution of tiamulin and valnemulin (10 ng/mL)

本文通过配制标准工作曲线和基质匹配校正曲线，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标作图，以基质匹配校正曲线和标准曲线斜率的比值来考察化合物的基质效应。图4表明，对于所选粉剂、针剂和合剂3种类型样品，经过优化的前处理方法所得的样液经过稀释后再进样，且进样量为2 μL，不存在明显的基质效应。因此，本方法无需使用基质匹配的标准曲线，采用溶剂标准曲线进行准确定量。

图4 不同样品中泰妙菌素和沃尼妙林的基质效应

Fig.4 Matrix effects of tiamulin and valnemulin in different

samples

2.7 线性关系、检出限和定量限

在本方法所确定的实验条件下，分别配制浓度为1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、30.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100.0 ng/mL 8个标准系列进行液质联用测定，以定量离子的响应峰面积（Y轴）对相应的质量浓度（X轴）作图，其结果如图5所示。结果表明，泰妙菌素和沃尼妙林在1.0～100 ng/mL范围内，定量离子的响应峰面积和样品浓度之间有良好的线性关系，相关系数均大于0.999。

根据最终样液所代表的试样量、定容体积、进样量和进行测定时所受的干扰情况，以添加法确定液相色谱-串联质谱法对泰妙菌素和沃尼妙林的检出限为0.05 mg/kg，定量限为0.1 mg/kg，满足国内外的限量要求。

2.8 回收率和精密度

分别选取不含泰妙菌素和沃尼妙林的鱼腥草注射液、双黄连口服液和麻杏石甘颗粒为空白样品基质，在1、2、10倍测定限的添加水平上进行添加回收试验，每个水平做6次平行实验，测得方法的回收率范围为82.0%～106.5%，精密度范围为2.89%～8.95%，其检测结果见表4。

图5 （a）泰妙菌素和（b）沃尼妙林的液相色谱-串联质谱线性关系图

Fig.5 LC-MS/MS linear relationship of (a) tiamulin and

(b) valnemulin

3 实际样品检测

试验对43种兽用中药制剂（包括粉剂、针剂和合剂）进行了前处理，按照建立的色谱和质谱条件进行分析，样品均为未检出。参照农业农村部公告235号的规定，泰妙菌素、沃尼妙林等抗生素类药物未有超标使用情况。

4 结论

本研究建立了液相色谱-串联质谱法测定兽用中药制剂中泰妙菌素和沃尼妙林含量的方法。通过对各项参数的实验，使用固相萃取净化方法，使仪器检测的灵敏度和准确性达到最优。两种化合物在1.0～100 ng/mL浓度范围内线性关系较好，线性相关系数（R²）均大于0.999，方法的检出限为0.05 mg/kg，定量限为0.1 mg/kg。所有化合物在3个添加水平下的方法回收率在82.0%～106.5%之间，精密度范围为2.89%～8.95%。该方法操作简单、准确，可为同时测定兽用中药制剂中泰妙菌素和沃尼妙林的含量提供一种检测方法。

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表4 泰妙菌素和沃尼妙林的回收率和精密度

Table 4 Recovery and precision of tiamulin and valnemulin

基金项目：海关总署科研项目（2021HK262）

第一作者：杜鹃（1987—），女，汉族，天津人，硕士，工程师，主要从事动物分子系统学、分子生物学工作，E-mail: dujuan1987@sina.com

通信作者：马毅（1979—），男，回族，天津人，硕士，主要从事卫生检疫工作，E-mail: 2574596614@qq.com

共同通信作者：董志珍（1965—），女，汉族，内蒙古呼和浩特人，硕士，研究员，主要从事动物产品及食品检验检疫工作，E-mail: dongzhizhen@hotmail.com

1. 天津国际旅行卫生保健中心（天津海关口岸门诊部） 天津 300456

1. Tianjin International Travel Healthcare Center (Tianjin Customs Port Outpatient Departments), Tianjin 300456