王仲敏 宋喆 王全新 王飞 王乃福 刘培 高旗利

嗜肺军团菌是主要存在于各类水环境中的革兰阴性杆菌，尤其是各类人工水环境如温泉水、淋浴喷头、空调冷却塔及供水系统内广泛存在^[1-2]。该菌能形成气溶胶，通过呼吸道吸入引起肺部感染，形成军团病，一旦暴发流行对人群危害极大，死亡率高达15%～30%^[3]。嗜肺军团菌有15个血清型，据美国疾病预防控制中心报道，嗜肺军团菌肺炎中约85%由嗜肺军团菌血清1型（Lp1）引起。我国多地人工水环境监测结果表明，有嗜肺军团菌检出的样本中以Lp1为主^[4-5]。现阶段，Lp1的检测方法为传统的培养分离鉴定法^[6-7]，检测周期长达十余天，费时费力，不能满足流行病学调查和突发事件快速检测的需要。本研究以嗜肺军团菌O抗原基因簇wzt基因为靶基因^[8]，设计了一对特异性引物和探针，探索通过荧光PCR的技术，实现Lp1快速准确检测。

1 实验材料

1.1 培养基及生化试剂

普通营养琼脂NA（北京陆桥公司）；军团菌缓冲液活性炭酵母培养基BCYE（海博生物技术有限公司）；全基因组DNA提取试剂盒（北京时代为天科技有限公司）。

1.2 仪器

荧光PCR扩增仪（罗氏LightCycler 480 II）；离心机（Eppendorf，5417R，Germany）；浊度仪（Densimat BioMerieux）。

1.3 实验菌株

供试菌株共26株，其中，军团菌属8种共24株，包含嗜肺军团菌15个血清型，以及铜绿假单胞菌和沙门氏菌各1株。菌株样本分别来自美国典型培养物保藏中心、英国国家标准菌库、德国微生物和细胞培养物收藏中心、中国医学细菌保藏管理中心及实验室自备菌株（表1）。

2 实验方法

2.1 实验菌株培养

军团菌菌株接种于BCYE平板，2.5% CO₂，36℃下纯培养3～5 d；铜绿假单胞菌菌株、沙门氏菌菌株接种于NA平板，36℃下纯培养1～2 d。挑取单个菌落，用生理盐水制备0.5麦氏单位菌悬液。

2.2 细菌全基因组DNA提取

取1.5 mL菌悬液，用试剂盒提取细菌DNA，方法详见天为时代科技有限公司的细菌全基因组DNA提取试剂盒说明书，所提取DNA溶于50 μL TE中，-20℃保存。

2.3 荧光PCR引物和探针的设计和筛选

以嗜肺军团菌O抗原基因簇的wzt基因为靶基因，用Primer 5.0、Clustal X等软件分析靶基因序列，设计引物及探针。经评估实验后，筛选出一对特异性较好的引物及TaqMan探针，目标序列长度约为172 bp。

上游引物：5'-GCATGGCAGAATTGTCGGTG -3'；下游引物：5'-AACTCGGTTAAGCTTAAGGGAA-3'；

探针：5'（FAM）-CAGTCATGGATATCACTCG CGACTATCTC-（BHQ1）3'。

2.4 反应体系和反应条件

反应体系为25 μL，其中2×Premix Ex Taq 12.5 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L）和探针0.5 μL（10 μmol/L），模板DNA 1 μL。

反应条件为95℃预变性10 min；95℃变性15 s，56℃ 50 s，40个循环。

2.5 特异性试验

将所有供试菌株（表1）按2.2所述方法提取细菌DNA，使用2.3中引物、探针进行实时荧光PCR检测，以金黄色葡萄球菌作阴性对照。

2.6 灵敏度试验

取菌量为0.5麦氏单位的Lp1（ATCC 33152），用双蒸水进行10倍梯度稀释，分别从10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7梯度稀释液中吸取100 μL到BCYE培养基上，用L棒在培养基上均匀涂布，每个稀释梯度做2个平皿重复，置于2.5% CO₂，36℃环境条件下培养3～5 d后计数。培养完成后，每个稀释梯度各取1 mL菌液进行模板制备，用作荧光PCR灵敏度试验。

2.7 重复性试验

取0.5麦氏单位菌悬液，稀释至10^-4、10^-5、10^-6高、中、低3个不同浓度，分别提取各样本DNA进行实时荧光PCR扩增，每个浓度梯度样本分别做3次重复，读取扩增反应Ct值（每个反应管内荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数），计算Ct值变异系数（CV），变异系数 CV =（标准偏差 SD÷平均值Mean）× 100%，验证检测体系的稳定性。

2.8 荧光定量PCR阳性结果判定

PCR扩增呈明显S形，且Ct值＜35，则检测结果判定为阳性；35≤Ct值≤40，则需要对检测样本进行重复实验，2次试验结果均为35≤Ct值≤40，则检测结果判定为阳性；Ct值＞40，则检测结果判定为阴性。

3 结果与分析

3.1 特异性试验结果

图1为特异性试验结果，3株Lp1菌株实时荧光PCR检测Ct值均在17～18之间，有典型扩增曲线产生，试验结果具有高度的同一性。而表1中其他供试菌株都没有产生特异扩增曲线，表明本组引物探针具有很好的检测特异性。

图1 特异性试验结果

Fig.1 Specificity test

3.2 灵敏度试验结果

图2 为检测灵敏度试验结果，Lp1（ATCC 33152）不同稀释梯度平板计数结果显示，10^-3～10^-7稀释梯度的菌落数分别为1.4×10⁵CFU/mL 、1.3×10⁴ CFU/mL 、1.2×10³ CFU/mL、1.1×10² CFU/mL、12 CFU/mL。对不同稀释梯度菌液提取DNA模板，进行实时荧光定量检测。菌含量为1.4×10⁵ CFU/mL样本Ct值最小，为24.7；菌含量为1.1×10² CFU/mL时，Ct值为34.8；菌浓度为12 CFU/mL时，未出现扩增曲线。因此，本方法的检测低限为1.1×10² CFU/mL。

3.3 重复性试验结果

图3为重复性试验结果，取Lp1（ATCC 33152）高、中、低3个不同浓度菌悬液（0.5麦氏单位菌悬液，取10^-4、10^-5、10^-6稀释度），1.3×10⁴ CFU/mL 、1.2×10³ CFU/mL、1.1×10² CFU/mL，每个梯度做3个重复，计算各重复样品Ct值变异系数，分别为0.51%、0.42%、0.31%。结果显示，该方法的重复性很好。

图3 重复性试验结果

Fig.3 Repeatability test

4 讨论

作为军团病的主要致病菌，嗜肺军团菌由于其易在水环境中定殖，且可借助气溶胶吸入而引起感染等特点，可能引起军团病的集中暴发^[9]。基于嗜肺军团菌对人类健康的危害，越来越多的政府和机构关注嗜肺军团菌的普查及检测研究^[10-12]，目前已报道的嗜肺军团菌有15个血清型，与人类疾病关系最密切的是嗜肺军团菌血清1型（Lp1），其次为Lp4和Lp6 ^[13]。本实验室拟分别建立Lp1、Lp2、Lp6的实时荧光PCR检测方法，并在相关研究的基础上研发3种血清型的多重实时荧光PCR检测技术，从而对上述3种血清型进行一次性检测鉴定。

O抗原是革兰阴性菌外膜的重要组分，染色体中有关O抗原合成的基因丛集成簇，这些基因簇的变异很大，使得O抗原结构产生多样性。而嗜肺军团菌中的脂多糖 ，由多个重复的单糖单位组成^[14]，其单糖的数量、种类以及单糖之间键、寡糖单位之间键等不同也构成O抗原的多样性。嗜肺军团菌也是基于O抗原的不同分为15个血清型，虽然O抗原种类较多，但其具有固定的结构模式，负责O抗原合成的所有酶分子的基因常在染色体上相邻存在，形成一个基因簇^[15]，主要由单糖合成酶基因、糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因三部分构成。嗜肺军团菌O抗原合成过程依赖ABC转运系统，即ABC转运子和ABC转运蛋白（结合ATP），分别由wzm和wzt基因编码。其中，wzt蛋白是ABC转运系统的亲水成分，有一个保守的ATP结合结构域，结合-水解ATP来为运输系统提供能量。

本研究以嗜肺军团菌O抗原基因簇wzt基因为靶基因，设计特异引物和探针，建立了嗜肺军团菌血清1型荧光PCR检测方法，适用于各类水环境中Lp1的快速检测鉴定。实验表明，该方法特异性强，能够准确检测出Lp1，与其他参考菌株没有发生交叉反应；灵敏度高，菌液的检测底线可达到1.1×10² CFU/mL；重复性好，高、中、低每个稀释度做3次重复，Ct值差异极小；可实现仪器自动化操作，全部扩增反应过程都在密闭的管内进行，大大减少扩增产物污染的机会；操作简单，结果判定简洁明了，整个检测过程仅需2 h。对比不同模板DNA提取方法，本研究推荐使用试剂盒提取法进行DNA提取，能够最大限度保证扩增效果，提升检测质量。进行Lp1检测时，若进一步提高检测底线，可通过膜过滤法浓缩水样中的细菌，使目标菌菌浓度达到检测底线的要求。

参考文献

[1] Makiko, Yoshida, Naoko. Legionella pneumophila contamination of hospital dishwashers[J]. American Journal of Infection Control, 2018, 46(8): 943-945.

[2]张海霞, 万博宇, 孙晓冰, 等. 2017年北京市某区公共场所生活热水中嗜肺军团菌污染状况[J]. 职业与健康, 2018, 34(15): 2118-2120+2126.

[3]朱庆义. 军团菌和军团菌病的诊断[J]. 中华检验医学杂志, 2011, 34(2): 178-189.

[4]金萍, 江晓, 叶艳华, 等. 传统细菌培养法与荧光PCR法分离公共场所嗜肺军团菌结果比较[J]. 中国医学创新, 2014, 11(14): 117-118.

[5]李莉, 陈晓东, 许慧慧, 等. 三城市公共场所集中空调系统污染现状调查[J]. 环境与健康杂志, 2010, 27(3): 206-207.

[6] GB/T 40392—2021 循环冷凝水中军团菌的检测[S]. 北京: 中国标准出版社, 2021.

[7]杨闯, 李云峰, 张琳. 公共场所水源中军团菌的研究进展[J]. 口岸卫生控制, 2019, 24(4): 34-37+41.

[8]蔡成松, 郭晓奎. 细菌O抗原基因簇的研究进展[J]. 微生物学杂志, 2008, 28(3): 64-67.

[9] Sílvia Cervero-Aragó a b, A B S , C E D , et al. Viability and infectivity of viable but nonculturable Legionella pneumophila strains induced at high temperatures[J]. Water Research, 2019, 158: 268-279.

[10]李奕奉, 万博宇, 李文静, 等. 北京市朝阳区社区家庭淋浴热水中嗜肺军团菌污染状况调查[J]. 中国卫生检验杂志, 2023, 33(12): 1525-1527.

[11]方子思, 廖辉, 周筱丛, 等. 我国公共场所集中空调通风系统嗜肺军团菌污染的Meta分析[J]. 预防医学, 2023, 35(5): 425-430.

[12]王玲, 段刚, 廖春艳. 2020—2021年重庆市部分公共场所水系统嗜肺军团菌污染现况及毒力岛基因组携带情况[J]. 热带医学杂志, 2023, 23(3): 331-335.

[13]谢皙子. 军团菌家族及其致病性[J]. 国外医学: 微生物学分册, 1996, 19(5): 23-25.

[14] Bastin D A, Reeves P R. Sequence and analysis of the O antigen gene (rfb) cluster of Escherichia coli O111[J]. Gene, 1995, 164(1): 17-23.

[15] Reeves P R. Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature[J]. Trends in Microbiolgy, 1996, 4(12): 495-503.

表1 实验菌株

Table 1 Experimental strains

注: a为美国典型培养物保藏中心（ATCC）; b为英国国家标准菌库（NCTC）; c为德国微生物和细胞培养物收藏中心（DSMZ）; d为中国医学细菌保藏管理中心（CMCC）; e为自备菌株.

表1（续）

图2 灵敏度试验结果

Fig.2 Sensitivity test