倪永付 王勇 高瑞刚 高洁 王鹏 白翔

Abstract A method for the determination of Phenylethanolamine A residues in meat products by automatic solid phase extraction-liquid chromatography tandem mass spectrometry was established in this paper. The sample was extracted with ammonium acetate buffer solution under enzymolysis condition, and purified by MCX solid phase extraction column in automatic solid phase extraction.The eluent was dried by nitrogen at 45℃, and 1.0 mL 0.1% formic acid solution was added for dissolution and detection. Using Poroshell 120 EC-C₁₈, 100 mm×3.0 mm (i.d), 2.7 μm chromatographic column separation, the sample was detected in multi reaction monitoring mode of mass spectrometry, and was quantified by internal standard method. The results indicated that Phenylethanolamine A had a good linear relationship in the concentration range of 1.0-100.0 μg/L, with the correlation coefficient of r = 0.9993.The detection limit (LOD) was 0.2 μg/kg, with the quantification limit (LOQ) 0.5 μg/kg. At different levels of addition, the average recovery rate were 90.5%-103.3%, and the coefficient of variation were 2.2%-7.0%. The established method can automatically purify the samples, improve the detection efficiency, and is suitable for the detection of Phenylethanolamine A residues in meat products.

Keywords automated solid phase extraction; liquid chromatography tandem mass spectrometry; meatproducts; Phenylethanolamine A; residues

苯乙醇胺A（Phenylethanolamine A）属于β-受体激动剂类药物^[1]，其分子式为C₁₉H₂₄N₂O₄，一般以盐酸盐的形式存在，是一种新型营养重分配剂^[2]，具有与克伦特罗、莱克多巴胺等相同的作用和效果，其结构式如图1所示。

图1 苯乙醇胺A结构式

Fig.1 Structural formula of Phenylethanolamine A

苯乙醇胺A结构上与莱克多巴胺类似，用于猪、牛等饲养，能够刺激生长、加速代谢，促进动物体内脂肪分解、蛋白质沉积，使其长速加快、皮红毛亮、瘦肉率高。而人吃了含这种药物残留的肉类后，会出现恶心、头晕、四肢无力、手颤等中毒症状^[3]，长期食用含有此类药物的食品可能诱发重大疾病，损害身体健康。原农业部曾于2010年发布第1519号公告^[4]，禁止在饲料和动物饮水中使用苯乙醇胺A。目前文献报道的苯乙醇胺A检测方法主要有液相色谱-串联质谱法^[5-7]、液相色谱法^[8-9]、胶体金法^[10]、酶联免疫法^[11]，其中液相色谱-串联质谱法因特异性强、灵敏度高，使用最为广泛。苯乙醇胺A的检测标准有原农业部公告^[12-13]、行业标准^[14]、地方标准^[15-17]等，涉及的产品基质主要为饲料、动物尿液，苯乙醇胺A的检测文献^[18-20]报道涉及的基质有饲料、猪尿、动物源性食品。现有的标准及文献涉及的前处理净化方法有固相萃取法、QuEChERS法，固相萃取法作为一款经典的净化方法具有其他净化方法无法取代的优势，但是固相萃取法操作繁琐，处理样品量有限，不适合高通量检测。随着仪器技术的发展，全自动固相萃取仪的出现满足了样品净化的全自动操作，提高了固相萃取效率，能够实现大批量样品的净化操作，在分析测试领域逐渐得到应用，被用于维生素^[21]、香味添加剂^[22]、内源性组分^[23]、兽药残留^[24-26]等的检测。本文采用全自动固相萃取结合液相色谱-串联质谱技术，建立肉类食品中苯乙醇胺A残留的检测方法，以期满足肌肉、内脏等产品中苯乙醇胺A残留的检测与监控。

1 实验部分

1.1 仪器和材料

1290-6460型液相色谱-串联质谱仪（美国Agilent公司）；CR22GⅢ型冷冻离心机（转速不低于9000 r/min）（日本HITACHI公司）；GM200 型研磨仪（德国IKA公司）；N-EVAP 112型氮吹浓缩装置（美国OrganomationAssosiates公司）；MS 3 basic型涡旋混匀器（德国IKA公司）；Fotector plus型全自动固相萃取仪（睿科集团股份有限公司）；SB-25-12DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）。

甲醇（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）、正己烷（天津市科密欧化学试剂有限公司）、乙酸乙酯（天津市光复精细化工研究所）、甲酸（天津市光复精细化工研究所），均为色谱纯；乙酸铵（天津市光复科技发展有限公司）、冰乙酸（天津市光复科技发展有限公司）、氨水（天津市科密欧化学试剂有限公司）、盐酸（烟台远东精细化工有限公司），均为分析纯；实验用水为一级水，实验室自制。β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶（β-葡萄糖醛酸酶活性＞100000 units/mL，芳基硫酸酯酶活性＜20000 units/mL，上海安谱实验科技有限公司）。MCX固相萃取柱：60 mg，3 mL（上海安谱实验科技有限公司）。

苯乙醇胺A，CAS：1346746-81-3，纯度＞98.0%；苯乙醇胺A-D3，CAS：2507994-61-6，纯度＞98.9%，均购于上海安谱实验科技股份有限公司。

实验样品购于市场；质控样为实验室制备，苯乙醇胺A含量1 μg/kg。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 外标溶液配制

准确称取苯乙醇胺A（含目标化合物100.0 mg）标准品，用甲醇溶解后，转移至100 mL容量瓶并定容，配制成1000 mg/L苯乙醇胺A标准储备液。使用液逐级稀释，现用现配。

1.2.2 内标溶液配制

准确称取苯乙醇胺A同位素内标（含目标化合物50.0 mg），用甲醇溶解后，转移至50 mL容量瓶并定容至刻度，配制成1000 mg/L苯乙醇胺A内标储备液。使用液逐级稀释，现用现配。

1.3 仪器条件

1.3.1 液相色谱条件

色谱柱：安捷伦Poroshell 120 EC-C₁₈，100 mm×3.0 mm（i.d.），2.7 μm；柱温：30℃；进样量：5 μL；流动相A：0.1%甲酸水，流动相B：甲醇；流速：300 μL/min。液相色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

Table 1 Gradient elution procedure for liquid chromatography

1.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI，带喷射流技术）；扫描方式：正离子扫描（+）；检测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压（Capillary）：4000 V；干燥气温度（Gas Temp）：325℃；干燥气流速（Gas Flow）：10 L/min；雾化气压力（Nebulizer）：40 psi；鞘气温度（Sheath Gas Temp）：350℃；鞘气流速（Sheath Gas Flow）：11 L/min。苯乙醇胺A及其内标母离子、子离子、碎裂电压、碰撞能量参考值见表2。

表2 苯乙醇胺A及其内标母离子、子离子、碎裂电压、碰撞能量

Table 2 Phenylethanolamine A and its internal standard parent ions, daughter ions, fragmentation voltage, collision energy

注: *为定量离子

1.4 样品处理

称取5 g样品，精确至0.01 g，置于50 mL离心管中，然后加入10 μg/L内标工作液200 μL，再加入20 mL 2 mol/L乙酸铵缓冲溶液，均质1 min，加入β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶40 μL，混合均匀，在37℃恒温水浴振荡器中酶解16 h。然后在4℃、9000 r/min条件下离心5 min，收集上清液于螺旋盖聚丙烯离心管中，加入20 mL正己烷，振荡混匀。4℃条件下9000 r/min离心5 min，弃去正己烷层，待净化。采用6通道全自动固相萃取仪进行净化，将MCX小柱置于全自动固相萃取仪，在样品架上对应位置放入样品提取溶液，依次用3 mL甲醇、3 mL水对MCX小柱进行活化，将上清液注入MCX小柱，分别用3 mL 0.1 mol/L盐酸、3 mL水、3 mL甲醇-水（50 + 50）溶液洗柱，弃去淋洗液；氮气吹干MCX小柱，用5 mL氨水-甲醇（体积比1∶19）进行洗脱，收集洗脱液。将洗脱液置于45℃条件下氮气吹干，然后准确加入1.0 mL 0.1%甲酸溶液溶解残渣，超声混匀，过0.22 μm有机相滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。

2 结果与讨论

2.1 提取与净化条件选择

为了使苯乙醇胺A从结合态完全变成游离态，需要加入β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶进行酶解，酶解后的样品用乙酸铵缓冲溶液提取。参照现有标准^[27-28]中关于酶解及净化的条件，确定40 μL β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶37℃条件下酶解16 h，使用20 mL乙酸铵对苯乙醇胺A进行提取。苯乙醇胺A与莱克多巴胺具有类似的结构，能够在MCX固相萃取柱上进行保留，通过淋洗、调节pH值即可达到去除杂质的目的。传统的固相萃取需要检测人员全程操作，耗时费力，全自动固相萃取能够自动完成柱活化、上样、淋洗、吹干、洗脱、收集等固相萃取的全过程，大大提高了样品前处理效率。本文选择全自动固相萃取的净化方式，并对活化、淋洗、洗脱等条件进行优化，实验结果表明，未经酸活化的MCX固相萃取柱获得的回收率更高，上述条件能够满足苯乙醇胺A的酶解、提取与净化要求，检测回收率达到90%以上。具体的全自动固相萃取步骤及参数见表3。

2.2 液相色谱条件优化

选择甲醇、乙腈、乙酸铵、水以不同比例进行测试，实验发现流动相只需要甲醇和水，调节二者的比例，在梯度洗脱的条件下即可很好地将苯乙醇胺A和杂质分开，产生较好的峰型；为了增加苯乙醇胺A的响应值，在水中加入甲酸，使其含量为0.1%。在色谱柱的选择上，普通C₁₈色谱柱即可满足苯乙醇胺A的检测分离，本文选用Poroshell 120 EC-C₁₈，100mm×3.0 mm（i.d.），2.7 μm色谱柱，柱温：30℃。

2.3 质谱条件优化

苯乙醇胺A在正离子模式下响应值高于负离子模式，因此采用正离子模式进行优化。首先进行一级质谱扫描，获取化合物的母离子、最佳碎裂电压；然后对选取的母离子进行选择离子监测扫描（SIM）、子离子扫描（Product Scan），获取化合物相应的碎裂能量、碰撞能量，确定在做多重反应监测时使用的定量离子和定性离子。通过优化获得的质谱参数建立苯乙醇胺A及其内标的多反应监测数据参数，苯乙醇胺A及其内标多反应监测色谱图如图2所示。

图2 苯乙醇胺A及其内标多反应监测色谱图

Fig.2 Multi reaction monitoring chromatogram of Phenylethanolamine A and its internal standard

2.4 方法的线性范围和检出限、定量限

制备浓度系列分别为1.0 μg/L、2.5 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L的苯乙醇胺A标准溶液，分别相当于测试样品含有0.2 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg目标化合物，每个浓度点均加入200 μL10 μg/L苯乙醇胺A-D3标准溶液。在优化的仪器条件下，进样5 μL，进行测定，获得苯乙醇胺A的线性回归方程为Y = 0.68X－0.10，相关系数r = 0.9993，表明在1.0～100.0 μg/L浓度范围内线性关系良好，符合检测要求。

分别在空白猪肉、牛肉、猪肝样品中添加0.2 μg/kg苯乙醇胺A时信噪比大于3，确定方法检出限为0.2 μg/kg，分别在空白猪肉、牛肉、猪肝样品中添加0.5 μg/kg苯乙醇胺A时信噪比大于10，确定该方法的定量限为0.5 μg/kg。猪肉、牛肉、猪肝定量限加标的多反应监测色谱图及信噪比如图3—图5所示，质控样多反应监测色谱图如图6所示。

图3 猪肉定量限加标多反应监测色谱图及信噪比

Fig.3 Multi reaction monitoring chromatogram and signal-to-noise ratio of pork quantitative limit

图4 牛肉定量限加标多反应监测色谱图及信噪比

Fig.4 Multi reaction monitoring chromatogram and signal-to-noise ratio of beef quantitative limit

图5 猪肝定量限加标多反应监测色谱图及信噪比

Fig.5 Multi reaction monitoring chromatogram and signal-to-noise ratio of pork liver quantitative limit

2.5 方法的精密度和回收率

选择猪肉、牛肉、猪肝样品进行0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、2.0 μg/kg 3个水平的加标回收实验，每个加标水平平行测定6次，实验结果表明，本方法具有较好的回收率和精密度，完全满足肉类食品中苯乙醇胺A残留量的测定要求。方法的精密度和回收率数据见表4。

图6 质控样多反应监测色谱图

Fig.6 Multi reaction monitoring chromatogram of quality control sample

2.6 样品分析

按照实验方法对实验室抽检的20批肉类食品及1份质控样进行检测，抽检样品中均未检出苯乙醇胺A残留，质控样检出苯乙醇胺A残留量为0.96 μg/kg，与实际情况相符（1 μg/kg）。

3 结论

本研究建立了全自动固相萃取-液相色谱-串联质谱测定肉类食品中苯乙醇胺A残留量的方法，通过优化前处理及净化条件、质谱条件和液相色谱条件，苯乙醇胺A及其内标物苯乙醇胺A-D3在6.5 min内能够实现很好的分离，分析周期短、净化效果好，减少了基质干扰，回收率高，该方法快速、实用，适用于肉类食品中苯乙醇胺A残留量的批量检测。

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表3 全自动固相萃取的步骤及参数

Table 3 Steps and parameters of automatic solid-phase extraction

注: “—”表示不进行相关操作

表4 猪肉、牛肉、猪肝加标试验的回收率及精密度（n = 6）

Table 4 Recovery rate and precision of standard addition experiments on pork, beef, and pork liver (n = 6)