李跃红 徐孟怀 蒋洪亮 张馨允 冉茂乾 焦彦朝 朱明

黄曲霉毒素是黄曲霉、寄生曲霉和特异曲霉等一类产毒菌株的代谢产物，主要存在于霉变的花生、玉米、坚果、油料及其制品等食品中^[1]，尤其以黄曲霉毒素B₁（Aflatoxin B₁，AFT B₁）最为多见，其毒性和致癌性也最强，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍，此外还具有致畸和致突变作用^[2-3]。玉米及其制品是我国主要粮食作物，易发生霉变。为了最大限度地控制黄曲霉毒素的摄入量，我国制定了GB 2761—2017 《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》^[4]，其中规定玉米及玉米制品中最大限量水平≤20 μg/kg，并且建立了食品中黄曲霉毒素的检测标准^[5]。

目前，黄曲霉毒素检测方法主要有酶联免疫法、薄层色谱法、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法^[6]，其中以高效液相色谱法最为常用。能力验证是利用实验室间检测结果比对来评判实验室检测机构能力的活动^[7]，它是认可机构判断实验室能力的重要技术手段，也是评价实验室检测人员能力、实验室质量管理水平、促进实验室认可和国际交流的重要途径^[8]。基于此，为了提高实验室对食品中真菌毒素的定量测定能力以及了解各类实验室黄曲霉毒素检测的整体水平，本实验室参加了中国检验检疫科学研究院组织的项目ACAS-PT1040“玉米粉中黄曲霉毒素B₁的测定”能力验证（样品编号20-P198、20-U632），通过高效液相色谱-柱后碘衍生法对盲样进行检测，并对本次能力验证实施过程中实验设计、质量控制方法和检测结果等关键环节进行分析评价，以期为食品中黄曲霉毒素的相关检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验样品

能力验证样品：2袋玉米粉样品，每袋约40 g，黄色干燥粉末，铝箔袋真空包装，常温运输且包装完好，样品编号为20-P198和20-U632，由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供；质控样品：玉米粉，样品编号为CFAPA-QC447B-1，树脂瓶包装，黄色干燥粉末，约30 g，由大连中食国实检测技术有限公司提供。

1.1.2 实验试剂和材料

甲醇（色谱纯，德国CNW公司，上海安谱实验科技股份有限公司）；AFT B₁标准品（浓度为1 μg/mL，北京坛墨质检科技有限公司）；氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、盐酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；碘（分析纯，中国医药公司北京采购供应站）；实验室自制超纯水；黄曲霉毒素B₁/B₂/G₁/G₂免疫亲和柱（HCM0125B，3 mL 25支/盒，北京华安麦科生物技术有限公司）。

1.1.3 实验仪器

UFLC-XR高效液相色谱仪，配荧光检测器（日本岛津公司）；ST16R离心机、MicroPure UV/UF超纯水仪（美国Thermo Fisher公司）；IKA Vortex3涡旋混合器（德国IKA公司）；JHQ-24C固相萃取装置24孔（上海极恒实业有限公司）；ME303E分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理方法

准确称取2 g样品，加入0.5 g 氯化钠与 25 mL 70%甲醇-水溶液，充分混匀提取20 min，离心过滤，收集滤液，取10 mL 滤液加入 20 mL水稀释并混匀，再用微纤维滤纸过滤，收集滤液作为上样液，待净化。取15 mL上样液过免疫亲和柱，经1 mL甲醇洗脱，收集洗脱液并定容至1 mL，经0.22 μm滤膜过滤后供液相色谱仪分析。

1.2.2 参考色谱条件

色谱柱：C₁₈ 柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；流动相：甲醇︰水= 42︰58（V︰V），等度洗脱；流速1.0 mL/min；柱温40℃；进样量：50 μL；衍生溶液：0.05%碘溶液；衍生溶液流速：0.2 mL/min；衍生反应温度70℃；激发波长360 nm，发射波长440 nm。

1.2.3 质量控制方法

本次能力验证采用质控样品实验、加标实验和双人比对实验3种实验室内部质量控制措施对检测过程及结果进行控制。

1.3 数据处理与结果评价

采用Excel 2007分析软件对实验数据进行整理分析，能力验证计划以中国检验检疫科学研究院测试评价中心给出的Z比分数来评价参加实验室的结果。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

在上述参考色谱条件下，实验员A和实验员B均使用高效液相色谱-柱后碘衍生法对系列标准溶液进行测定，制作标准曲线，其线性回归方程和相关系数见表1。可以看出，两组实验的线性回归方程的相关系数均大于0.9999，表明线性关系良好，满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中校准曲线的相关要求。

表1 线性回归方程

Table 1 Linear regression equation

2.2 精密度试验

选择1.0 ng/mL的AFT B₁标准液，按上述色谱条件分析方法，上机分别连续进样6次，结果见表2，可知平均峰面积分别为121649 mv·min、141592 mv·min，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为0.31%、0.40%，RSD值均小于5%，符合GB/T 27404—2008 的有关要求，表明仪器精密度良好。

2.3 质控样品试验

为确保能力验证实验数据的准确性，实验过程中使用已知浓度的AFT B₁的质控样品和能力验证样品按照1.2.1节所述进行相同方法的样品前处理，以及相同仪器条件进行上机测定。此次质控样品实验采取双人3次平行，试验结果见表3。由表3可知，两组平行实验的平均值分别为4.41 μg/kg和4.22 μg/kg，RSD为0.80%和0.86%，均在质控样品的参考值区间内，说明该实验方案对样品前处理和仪器测定方法是正确的，结果可控。

2.4 能力验证样品试验

称取2份能力验证样品，采取双人2次独立实验，按照1.2.1节所述样品前处理和上机测定样品中AFT B₁含量，计算AFT B₁的精密度，结果见表4。由表4可看出，实验员A的20-P198和20-U632的2次独立实验平均值分别为4.53 μg/kg和8.71 μg/kg，精密度为4.19%和3.56%，实验员B的20-P198和20-U632的2次独立实验平均值分别为4.49 μg/kg、8.47 μg/kg，精密度为2.25%和3.07%，2组实验精密度均小于5%，符合GB 5009.22—2016第三法高效液相色谱-柱后碘衍生法对精密度的要求（在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的20%)。

表4 能力验证样品试验结果

Table 4 Results of reference proficiency test

2.5 加标回收试验

由于能力验证样品量有限，故本次实验只考虑选取1个水平作为加标试验，采取双人3次平行试验，按照1.2.1节所述样品前处理和上机测定样品中AFT B₁含量，计算AFT B₁的加标回收率，结果见表5。两个实验组的平均加标回收率为91.4%～102.6%，满足GB/T 27404—2008中含量小于0.1 mg/kg样品回收率的要求（回收率范围应为 60%～120%），RSD分别为0.89%、1.34%、1.07%、1.74%，表明本实验使用方法可靠，检测结果的准确度较高。

2.6 人员比对试验

通过2名实验室人员多次试验，结果对比见表3和表4，可知质控样品人员比对结果平均值的相对标准偏差为4.40%；编号20-P198和20-U632能力验证样品中AFT B₁的人员比对结果平均值的相对标准偏差分别为0.89%和2.79%；编号20-P198和20-U632能力验证样品中AFT B₁的加标回收率人员比对结果平均值的相对标准偏差分别为7.38%和8.59%，可见相对标准偏差均小于10%，说明实验中样品比较均一稳定，检测结果受检测人员差异影响较小。

表5 加标回收试验结果

Table 5 Results of spiked recovery test

2.7 样品中黄曲霉毒素B₁的确定与评价

本次能力验证设计的2组实验的标准曲线线性关系良好，采用加标回收试验、质控样品试验、人员比对试验手段对能力验证样品进行有效控制，质控样品的测定结果在质控样品参考值区间，加标回收率在91.4%～102.6%之间，均满足GB/T 27404—2008相关要求。综合考虑，实验员A质控样品的测定值比较接近特性值，且能力验证样品加标回收率较好，故本次能力验证以实验员A的平均值4.53 μg/kg和8.71 μg/kg作为编号20-P198和20-U632玉米粉中AFT B₁含量报出值。根据|Z|≤2.0为满意结果，2.0＜|Z|＜3.0为可疑结果，|Z|≥3.0为离群结果的原则^[9]，此次中国检验检疫科学研究院测试评价中心反馈能力验证结果的|Z|值分别为0.0、0.3，|Z|值均远远小于2且接近0，故能力验证结果满意。

3 讨论与结论

本研究对玉米粉中黄曲霉毒素B₁的测定能力验证结果与方法进行了分析。本次能力验证黄曲霉毒素B₁检测结果分别为4.53 μg/kg、8.71 μg/kg；样品|Z|值分别为0.0、0.3，样品|Z|值均远远小于2，能力验证结果满意。同时，实验室通过质控样品、加标回收、人员比对多种质控措施对能力验证盲样样品进行了有效控制，且加标回收率和校准曲线满足GB/T 27404—2008相关要求，检测结果满足GB 5009.22—2016精密度要求，有效性得到了确认。

通过此次能力验证及前期检测经验，实验室总结出以下注意事项：1）黄曲霉毒素B₁作为目前化学物质致癌性最强的化合物之一，在整个实验过程中，实验室应具备相对独立的操作台和废弃物存放装置，实验员应在指定的操作台区域内完成，务必做好相应的安全防护措施。2）黄曲霉毒素B₁对紫外光极为敏感，整个分析操作过程中应尽量避免阳光直射，配制的标准系列溶液和最后进样分析的样液应储存于棕色的玻璃中。3）样品提取时间不够、提取不完全、过免疫亲和柱流速过快、净化时洗脱液未完全接收、定容不准确等不规范操作容易导致能力验证结果有问题。实验人员检测前应对检测标准以及免疫亲和柱厂家说明书进行深入学习理解，注意提取试剂、提取时间和免疫亲和操作细节。4）检测仪器运行未完全稳定，色谱分析条件参数未达最优化，样品上机检测中目标色谱峰积分不准确也是造成检测结果有问题的原因之一。实验前，应尽量待检测仪器运行完全稳定，对色谱分析条件参数进行优化，以确保标准品上机检测色谱峰分离度良好，必要时可先用处理待测样上机优化流动相比例排除干扰峰影响，待目标色谱峰积分准确再进行下一步实验。5）为提高检测结果的准确性，首先，在收到样品以后，样品要按参试指导书操作进行保存，制定实验方案。使用实验室前期优化的检测条件进行预实验，然后根据预实验结果调整试样称取量和标准曲线的系列工作溶液浓度，使待测组分样液终浓度尽可能落在标准曲线浓度的1/3～2/3范围内。6）实验前，样品应恢复室温，充分振摇均匀后取样。7）柱后碘衍生试剂的稳定性也是影响检测准确性的原因之一。碘单质溶于甲醇微溶于水，适当提高溶剂中甲醇比例可以避免衍生试剂中碘单质析出，甲醇比例过高会影响黄曲霉毒素荧光强度，经前期优化本实验室将GB 5009.22—2016第三法柱后碘衍生法所用碘溶液中甲醇比例由12%（V∶V）提高至14% （V∶V）。8）在实验完成以后，应使用 5% 的次氯酸钠溶液浸泡所有实验用过的器皿，时间在30 min 以上为宜，使黄曲霉毒素 B₁ 分解成无毒的盐，避免造成二次污染。

此外，强酸、强碱对黄曲霉毒素B₁有明显的破坏作用^[10]，实验过程中应尽量远离这些试剂，避免影响检测结果；实验器材受到污染，试剂和标准品未按照要求保存、检测方法的理解不深、实验人员经验不足、标准品工作液的配制不准确也能影响实验结果，因此，在检测过程中应对这些因素进行核查，以确保这些因素得到合理有效的控制，符合检测要求，只有这样才能确保所出具检验数据的准确性。

参考文献

[1]王秀嫔, 李培武, 张奇, 等. 能力验证中粮油真菌毒素检测技术研究进展[J]. 中国油料作物学报, 2019, 41(4): 650-656.

[2]罗自生, 秦雨, 徐艳群, 等. 黄曲霉毒素的生物合成、代谢和毒性研究进展[J]. 食品科学, 2015, 36(3): 250-257.

[3]刘丽娜, 李耀磊, 金红宇, 等. 免疫亲和净化HPLC柱后光化学衍生荧光法测定动物药中黄曲霉毒素[J]. 中草药, 2017, 48(6): 1220-1224.

[4] GB 2761—2017 食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量[S].

[5] GB 5009.22—2016 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定[S].

[6]陈笑笑, 桑丽雅, 李康, 等. 一种快速检测植物油中黄曲霉毒素B₁的胶体金试剂板的研制[J]. 中国粮油学报, 2013, 28(7): 99-102.

[7]中国合格评定国家认可委员会. 能力验证规则: CNAS－RL02: 2018[Z]. 2018.

[8]李耀磊, 李海亮, 昝珂, 等. 远志药材中黄曲霉毒素B₁残留量测定能力验证研究[J]. 中国新药杂志, 2022, 31(4): 337-342.

[9]侯美倩. 实验室比对结果评价方法[J]. 山东化工, 2018, 47(20): 60-62.

[10]许妍妍, 董宇. 食用油中黄曲霉毒素 B₁ 含量的测定能力验证 [J]. 安徽农业科学, 2020, 48(22): 185-186.

第一作者：李跃红（1987—），男，汉族，贵州毕节人，硕士，工程师，主要从事食品分析与检验检测研究，E-mail: 1944629455@qq.com

1. 六盘水市口岸服务中心 六盘水 553000

2. 贵阳海关综合技术中心果蔬实验室 六盘水 553000

1. Liupanshui Port Service Center, Liupanshui 553000

2. Laboratory of Fruit and Vegetable Products of Comprehensive Technical Center of Guiyang Customs, Liupanshui 553000

表2 精密度试验结果（n = 6）

Table 2 Results of precision test (n = 6)

表3 质控样品试验结果

Table 3 Results of quality control sample test