王丹红 陈练洪 林妍 陈佳敏 陈佳东

Abstract This article developed a fish feed candidate matrix standard sample with both protein and cadmium characteristic values, and completed the preparation, certification and uncertainty evaluation of the reference material. The homogeneity test, stability test, multi-laboratory collaborative certification and uncertainty analysis were carried out.According to the fish feed formula, fish meal, seaweed powder and soybean containing certain protein and cadmium background were fully mixed, pulverized, sieved, dried and packaged to prepare the candidate matrix reference material for quantitative analysis of crude protein and cadmium in fish feed. The homogeneity assessments, stability test, collaborative calibration by multiple laboratories and uncertainty analysis were carried out.The results showed that the homogeneity and stability of the candidate matrix reference material were good, and the final characteristic value of crude protein content was 50.1 g/100 g (dry basis ), the uncertainty was 0.7 g/100g (k = 2, p = 0.95), and the cadmium content was 0.298 mg/kg (dry basis ) , and the uncertainty was 0.012 mg/kg ( k = 2, p = 0.95). The candidate matrix reference material can be used for quality control, solving the problems encountered in the analysis and ensuring the accuracy of the results, etc. For the feed industry, accurate detection of protein and cadmium content is beneficial for the quality and pollutant monitoring of feed, thereby effectively controlling feed costs and hygiene safety.

Keywords matrix reference material; feed; protein; cadmium; setting value

食品安全已成为国家和全社会关注的热点问题。饲料是食品的源头之一，是保证动物生长的主要食品，饲料中粗蛋白含量是其营养指标中一项重要指标，蛋白质水平高低是影响饲料成本的重要因素^[1-3]。镉（Cd）是较易蓄积在生物体内、危害人体健康的有毒重金属，联合国环境规划署提出的12种具有全球意义的危险化学物质中，镉位列首位^[4-6]。

标准物质有两类：一类是纯标准品，即纯化学物质的标准物质；另一类为基体标准样品，基体标准样品在分析检测中具有重要意义^[7-9]，在食品^[10-11]、土壤^[12]、环境^[13]等领域得到了广泛开发和应用。配合饲料样品本身基体较为复杂，单纯采用纯标准品来校准检测体系难以满足质量控制要求，需要同时采用纯化学物质标准品与基体标准样品进行校准。目前，国内尚未见同时含粗蛋白和镉两个特性值的饲料标准物质，如鱼配合饲料成分分析标准物质（GBW(E)100533）特性值是粗蛋白、粗脂肪和粗灰分，而鸡浓缩饲料成分分析标准物质（GBW10244）和猪浓缩饲料成分分析标准物质（GBW10243）都只有元素特性值 ^[14]。另外，有黄曲霉毒素饲料基体标准物质的研究^[15]，国外饲料基体标准样品主要含黄曲霉毒素或转基因指标^[16]。对于鱼饲料复杂基质样品，采用标准样品进行质量控制十分重要。因此，本研究的目的是研制含粗蛋白和镉的鱼饲料定量分析标准样品，可用于证明检测工作与所要求的标准操作程序相符或用于质量控制、校准仪器和解决分析中遇到的问题。

1 实验部分

1.1 原料的选择

鱼配合饲料所需的主要原料有鱼粉、海藻粉和大豆粕预混料，这些原料可以提供蛋白质来源且含有镉的自然本底。收集不同来源的原料并测定各原料中粗蛋白质和镉含量，按照鱼饲料的配方可估算鱼饲料中粗蛋白质和镉含量。

1.2 样品的制备

按照鱼饲料配方将所选的原料进行充分混合粉碎后过80目筛，80℃烘1 h后冷却至室温，用牛皮纸袋装送至实验室进行均匀性试验的预试验，然后将制备好的鱼饲料样品称重分装于50 mL塑料瓶中，封口后旋上盖子，贴上对应的标识，于3～8℃冰箱中保存，以备进一步做均匀性和稳定性检测。

1.3 粗蛋白和镉含量检测方法

粗蛋白、镉含量检测分别依据GB/T 6432—2018 《饲料中粗蛋白的测定 凯氏定氮法》和GB/T 13082—2021《饲料中镉的测定》。标准样品应于101～105℃烘3 h后再进行检测，最终结果以干基计。

1.4 均匀性检验

按照GB/T 10111—2008《随机数的产生及其在产品质量抽样检验中的应用程序》的规定，实施系统随机抽样，采用单因素方差分析法进行数据统计分析。共抽取15个样品，对抽取的每个样品，在重复条件下进行3次平行测试。

1.5 稳定性检验

稳定性检验参照GB/T 15000.3—2008《标准样品工作导则(3) 标准样品 定值的一般原则和统计方法》进行。本研究长期稳定性试验进行了36个月，根据时间长度先密后疏的规律，在每个时间点随机抽取样品检测特性值含量，在监测期内共抽取45个样品，对得到的数据采用t检验进行统计学显著性检验。

短期稳定性试验主要考虑运输条件下样品的稳定性，以考察是否满足协同定值时的快递要求，设计模拟极端运输条件，将独立包装的样本（各3份）分别置于-40℃、室温条件下以及4℃保存7 d后测定；同时于夏季取3份独立包装的样本邮寄至海南，去程带有冰块，回程处于自然环境。检测各个温度点下的特性值含量，采用单因素方差分析法进行数据统计分析。

1.6 定值与不确定度评定

1.6.1 定值方法与数据处理

采用9家具有检测资质的实验室协同定值的方案，对鱼配合饲料中粗蛋白质和镉的标准样品进行定值。检测数据收集后，对9家实验室的检测值依次采用了爱泼斯-普利（Epps-Pulley）检验、柯克伦（Cochran）检验及格拉布斯（Grubbs）检验进行检验。

1.6.2 不确定度评定

标准样品的不确定度来源包括定值标准不确定度u_char、瓶间标准不确定度u_bb、长期稳定性标准不确定度u_lts、短期稳定性所引起的不确定度u_sts。

2 结果与讨论

2.1 均匀性检验结果

采用单因素方差分析法对特性值的均匀性数据进行分析，结果见表1。查F分布表，找出临界值F_0.05（14, 30）= 2.037。结果表明，粗蛋白及镉两个特性值的F值均小于临界值F_0.05（14, 30），即显著水平α = 0.05时，所研制样本是均匀的。

2.2 稳定性检验结果

2.2.1 短期稳定性

采用单因素方差分析法（F-检验），检测数据及分析结果见表2。在显著水平α = 0.05时，粗蛋白及镉两个特性值的F值均小于F_0.05（3, 8）= 4.066，从而可以判定所研制的含粗蛋白质和镉的鱼饲料候选基体标准样品在各种条件下7 d内是稳定的，可满足短期运输协同定值需要。

2.2.2 长期稳定性

对36个月内监测到的45个数据进行最小二乘法线性回归y = β₀ + β₁t（y为特性值监测值，t为间隔时间），采用t检验法检验统计学显著性。稳定性研究结果见表3，对于95%的置信水平，t_(95,n-2)＝2.16，两个特性值的t_|β1|均小于t_(95,n-2)，表示斜率β₁与0无显著性差异，无不稳定趋势，即判定样品是稳定的。

2.3 溯源和定值数据处理

本研究所用的标准物质均为国家有证标准物质，通过参加饲料能力验证的方式进行外部质控，参与协同定值的实验室均通过了国家计量认证。

为保证各实验室的检测值无异常值，对9家实验室共54组数据进行数据分析。爱泼斯-普利（Epps-Pulley）检验对检测数据进行正态分布检验，柯克伦（Cochran）检验是对实验室内变异的检验，格拉布斯（Grubbs）检验主要是对实验室间变异的检验，结果见表4。

当n = 54，粗蛋白质和镉的Epps-Pulley检验的T_EP均小于临界值0.374，表明检测数据符合正态分布；Cochran检验统计量C均小于临界值C_0(5%) = 0.329，表明检测数据无可疑值和离群值；单值Grubbs检验统计量G₁值均＜G_1(5%) = 2.387，双值Grubbs检验统计量G₂值均＞G_2(5%) = 0.1492，表明检测数据无异常值。因此54组数据均可参与定值。本研究定值最终是协同定值实验室提供结果的平均值，粗蛋白质含量为50.1 g/100 g（以干基计），镉含量为0.298 mg/kg（以干基计）。

2.4 不确定度评定

根据GB/T 15000.3—2008，短期稳定性主要考虑运输条件下的稳定性，通过短期稳定性研究可知，在4种温度条件下，该候选基体标准样品是稳定的，而且测定值均在最终确定值范围内，即短期稳定性不会造成认定值不确定度的扩大，因此，相对于长期稳定性，短期稳定性引起的不确定度分量可忽略不计。故该鱼饲料候选基体标准样品不确定度由3部分组成，各分量和合成不确定度见表5。在置信水平为95%时，特性值粗蛋白质不确定度为0.7 g/100g（以干基计），镉不确定度为0.012 mg/kg（以干基计）。

表5 鱼饲料候选基体标准样品不确定度评定

Table 5 Uncertainty evaluation of the candidate matrix reference material of fish feed

2.5 最小取样量

通过对不同大小取样量进行瓶内均匀性试验研究来确定最小取样量。对本标准样品，选取取样量分别为0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g和0.6 g进行特性值粗蛋白质含量检测，试验结果见表6。

当取样量≥0.3 g，特性值检测结果的RSD趋于稳定。同时按照GB/T 6432—2018的方法精密度要求，粗蛋白质含量＞25%时，重复性相对标准偏差不超过1%，综合考虑不同取样量测定结果和检测方法要求，取最小取样量为0.3 g。当取样量为0.3 g时，另一特性值镉的RSD（n = 6）为0.6%，满足检测方法要求。

3 结论

对于基质较为复杂的饲料，在其营养指标蛋白质和污染物指标镉含量分析检测时，基体标准样品十分重要。本研究通过收集不同来源的饲料原料并测定各原料中粗蛋白质和镉含量，再按照鱼饲料配方将含有一定蛋白质和镉本底的鱼粉、海藻粉和大豆粕原料进行充分混合、粉碎、过筛、烘干和分装，制备得到鱼饲料中粗蛋白和镉定量分析候选基体标准样品。经均匀性检验、稳定性检验、多家实验室协同定值和不确定度分析，最终确定特性值粗蛋白质含量为50.1（±0.7）g/100g（以干基计）（k = 2），镉含量为0.298（±0.012）mg/kg（以干基计）（k = 2）。该鱼饲料候选基体标准样品可用于证明检测工作与所要求的标准操作程序相符或用于质量控制、校准仪器和解决检测过程中遇到的问题。

参考文献

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表1 鱼饲料候选基体标准样品均匀性检验结果

Table 1 Homogeneity test results of the candidate matrix reference material of fish feed

表2 鱼饲料候选基体标准样品短期稳定性检验结果

Table 2 Short term stability results of the candidate matrix reference material of fish feed

表3 鱼饲料候选基体标准样品长期稳定性检验结果

Table 3 Long term stability results of the candidate matrix reference material of fish feed

表4 鱼饲料候选基体标准样品9家实验室定值数据检验结果

Table 4 Test results of setting values from 9 laboratories of the candidate matrix reference material of fish feed

表6 鱼饲料候选基体标准样品不同取样量检验结果

Table 6 Test results of different sampleintake of the candidate matrix reference material of fish feed

基金项目：新疆维吾尔自治区重大科技专项项目（2020A03002-2）

第一作者：吴雪梅（1993—），女，汉族，四川成都人，本科，助理工程师，主要从事皮革固体废物的检测工作，E-mail: 915137928@qq.com

通信作者：刘俊（1978—），男，汉族，四川岳池人，硕士，正高级工程师，主要从事固体废物的检测与鉴别工作，E-mail: 47575290@qq.com

1. 成都海关技术中心 成都 610041

2. 乌鲁木齐海关 乌鲁木齐 830063

3. 四川航空汉莎食品有限公司 成都 610041

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2. Urumqi Customs District, Urumqi 830063

3. Sichuan Airlines Lufthansa Food Co., Ltd, Chengdu 610041