李美玲 钟亚 韩晓培 刘文枚 胡宏鲲 陈江

Abstract Based on the separation of dicyandiamide and biuret by hydrophilic interaction chromatography (HILIC), a high performance liquid chromatography (HPLC) method for the determination of biuret and dicyandiamide in compound fertilizers was established. This method solved the interference of dicyandiamide on the determination of biuret in compound fertilizers during the implementation of GB/T 22924—2008. The samples in the optimization method were extracted by 95% acetonitrile and separated by a Venusil HILIC chromatographic column. Acetonitrile and water (95:5) were used as the mobile phase, and were detected by diode array detector (DAD). In this system, the linear correlation coefficient (r) of biuret was 0.9994 in the range of 10-100 mg/L, and the linear correlation coefficient (r) of dicyandiamide line was 0.9996 in the range of 10-100 mg/L. Based on ternary compound fertilizer and ammonium nitrate, the recovery rates of biuret and dicyandiamide were 95.7%-100.1% and 95.8%-106.1%, respectively. The method can effectively separate biuret and dicyandiamide from fertilizer.

Keywords nitrogen-containing fertilizers; biuret; false positive; high-performance liquid chromatography

氮是尿素和复合肥料中的主要成分，在造粒过程中温度过高，会发生缩合反应，生成具有渗透性质的缩二脲。缩二脲含量过高时能引起种子的细胞脱水，会抑制种子发芽和灼伤农作物根系，使农作物萎靡、枯死^[1]。GB 38400—2019《肥料中有毒有害物质的限量要求》^[2]要求，在标明总氮含量时需对缩二脲含量进行检测和判定。肥料中缩二脲的检测仲裁法为GB/T 22924—2008《复混肥料（复合肥料）中缩二脲含量的测定》^[3]，但每种检测手段都有其缺陷。在具体实践中发现，当复混肥料（复合肥料）基底中含有与缩二脲化学性质相近的双氰胺时，高效液相色谱法、分光光度法均会因双氰胺的存在对缩二脲的检测产生一定干扰，从而影响测定结果准确度。为解决这一问题，本研究利用亲水作用色谱技术，建立了复混肥料中缩二脲与双氰胺检测方法，旨在能简便有效分离缩二脲与双氰胺。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Ultimate 3000高效液相色谱仪（赛默飞），1260高效液相色谱仪（安捷伦），Cary 100 UV-Vis紫外可见光光度计（安捷伦），超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 实验对象及试剂

实验对象：某企业提供的出境检验复混肥料。

试剂：缩二脲（标准品，纯度96.2%；CATO），双氰胺（标准品，纯度99.2%；first standard），乙腈（色谱纯，北京百灵威科技），磷酸二氢钾（分析纯，成都金山科技），实验用水为超纯水。

1.3 实验方法

1.3.1 GB/T 22924—2008规定方法

1）第一次检测方法。按照GB/T 22924—2008中液相色谱法，使用1260高效液相色谱仪，Polaris 5 C_18-A 色谱柱（250 mm×4.6 mm），流速：1.2 mL/min，柱温：室温，波长：200 nm，进样量：5 μL，流动相：10 g/L磷酸二氢钾∶甲醇=95∶5。随后，按照GB/T 22924—2008中分光光度法要求，使用Cary 100 UV-Vis紫外可见光光度计（安捷伦）进行检测。

2）第二次检测方法。按照GB/T 22924—2008中液相色谱法的检测要求，使用Ultimate 3000高效液相色谱仪（带UV-Vis光谱），Polaris 5 C_18-A 色谱柱（250 mm×4.6 mm）（安捷伦），流速：1.2 mL/min，柱温：室温，波长：200 nm，进样量：5 μL，流动相：10 g/L磷酸二氢钾∶甲醇= 95∶5。

1.3.2 优化方法

样品前处理：在干燥条件下称取样品约0.1～0.2 g（精确至0.0001 g）于25 mL烧杯中，加入10 mL 95%乙腈水，混匀，超声清洗器超声20 min，转移至25 mL容量瓶中，用95%乙腈稀释至刻度，摇匀，静置，过0.22 μm滤膜，得试样溶液。

仪器：Ultimate 3000高效液相色谱仪（赛默飞）。

仪器条件：Venusil HILIC色谱柱（4.6 mm×250 mm×5.0 μm）（Agela Technologies）；波长：200 nm（缩二脲）、220 nm（双氰胺）；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；柱温度：30℃；流动相：乙腈∶水= 95∶5等度洗脱。

2 结果与讨论

2.1 假阳性检出

在对一批次复混肥料进行检测过程中，第一次使用GB/T 22924—2008液相色谱法及分光光度法进行检测，发现其缩二脲含量结果均超过GB 38400—2019规定的限量要求。

第二次检测按照GB/T 22924—2008液相色谱法，仪器更换为带有光谱功能的高效液相色谱仪。在分析该批次复混肥的液相谱图时发现，样品中的杂质峰保留时间和缩二脲标准物质的保留时间基本一致。但是通过其吸收光谱发现阳性样品中目标峰的吸收波形与缩二脲标准物质的吸收波形不一致，且在GB/T 22924—2008中规定的200 nm处均有较强的吸收。向该批次样品中添加缩二脲标准物质，样品的液相保留时间图上仍然只有1个峰，两种物质存在明显的保留时间的重叠，但是通过吸收光谱查看发现该目标峰中有2个明显不同的吸收波形（图1），且与缩二脲的吸收波形不同，以此判定该样品缩二脲含量检测结果为假阳性，即第一次的检测结果不准确。

2.2 假阳性结果原因分析

对该批次假阳性样品进行调查，了解到与其他批次复混肥相比，该批次样品在生成过程中加入了增效剂双氰胺，用于抑制亚硝化单胞菌活性，减缓铵态氮向硝态氮转化。双氰胺与缩二脲拥有极为相似的结构式及官能团，因此在相近的波长范围内都具有较强的吸收，两种物质的结构式如图2所示。

图2 双氰胺（a）和缩二脲（b）的结构式

Fig.2 Structural formulas of dicyandiamide (a) and biuret (b)

通过紫外光谱确认双氰胺在缩二脲附近有较强紫外吸收，导致色谱法中缩二脲的吸收峰与双氰胺吸收峰重叠，表现为完全重叠峰或肩峰，如图3a、3b、3c所示。通过紫外光谱查看双氰胺与假阳性样品吸收波形，并与缩二脲标准物质对比，可基本判定假阳性样品中目标峰为双氰胺，如图3b、3c、3d所示。向不含有双氰胺及缩二脲的复混肥中添加双氰胺，与缩二脲、双氰胺、假阳性样品比对色谱图和紫外光谱图，验证得出假阳性样品中的物质实际为双氰胺。

分光光度法测定缩二脲含量的原理是基于缩二脲等物质在溶液中与Cu²⁺形成有色配合物的双缩脲反应，采用分光光度法检测缩二脲-Cu²⁺复合物浓度，再换算成缩二脲的质量分数，但铵态氮及含有酰胺键的不少脲基缩合物都有可能与Cu²⁺形成不同的有色配合物而干扰比色^[4-5]，且双氰胺的可见光吸收波长540 nm与缩二脲可见光吸收波长550 nm相近，猜测双氰胺的存在会干扰缩二脲含量的测定。

向不含有缩二脲及双氰胺的复混肥中添加缩二脲、不含有双氰胺及缩二脲的复混肥中添加双氰胺、不含有双氰胺及缩二脲的复混肥中添加双氰胺及缩二脲，以分光光度法测定缩二脲含量，3个样品均校正出有缩二脲含量，证明了双氰胺的存在会影响分光光度法测定复混肥中缩二脲的含量，数据结果见表1。

2.3 解决方法

基于亲水作用色谱技术^[6-7]建立复混肥中双氰胺和缩二脲的高效液相色谱检测方法。样品用95%乙腈提取后，采用Venusil HILIC色谱柱分离，乙腈与水（95∶5）为流动相^[8-10]，使用二极管阵列检测器（DAD）进行检测。在该体系下，双氰胺与缩二脲保留时间适中，分离完全，线性范围宽，能有效分离复混肥中的缩二脲和双氰胺。

2.3.1 色谱条件及前处理方法的选择

双氰胺、缩二脲属于分子结构带有氨基的有机胺类强极性化合物，常见的反相色谱柱（如C₁₈柱）对其保留非常弱，且缩二脲和双氰胺无法完全分离^[7]。对于含有氨基的化合物，考虑HILIC色谱柱对其进行色谱分离，在HILIC模式中，固定相是强亲水性的极性吸附剂（如未键合硅胶及氨基、二醇基等键合硅胶），流动相是水相缓冲液及与水互溶的极性有机溶剂（通常为乙腈），对强极性和强亲水性的化合物保留效果较好^[11]。

乙腈和甲醇作为通用的提取溶剂在残留检测方面应用广泛，但经实验证明乙腈作为提取溶剂，色谱峰峰形理想，回收率高，更适用于肥料中缩二脲和双氰胺的提取。

2.3.2 线性范围

分别称取缩二脲、双氰胺各200 mg，用水定容至100 mL，得2 mg/mL标准储备溶液，再用乙腈稀释得到10 mg/L、20 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L的混合标准溶液。缩二脲在10～100 mg/L范围内线性相关系数（r）为0.9994，回归方程y = 0.2312x + 0.0648；双氰胺在10～100 mg/L范围内线性相关系数（r）为0.9996，回归方程y = 3.1679x + 3.5599；缩二脲、双氰胺混合标准溶液液相色谱图如图4所示。

图4 缩二脲、双氰胺混合标准溶液的液相色谱图

Fig.4 Liquid chromatogram of mixed standard solution of biuret and dicyandiamide

2.3.3 回收率

取基质为不含缩二脲及双氰胺的硝酸铵钙（肥料级），只含有缩二脲的三元复混肥A，含有缩二脲及双氰胺的三元复混肥B，按1.3.2节中样品前处理方法配制样品。向样品中添加双氰胺、缩二脲标准物质，平行配制3份样品，通过液相色谱仪进行检测，计算回收率，色谱图如图5—图7所示，计算结果见表2。

图5 硝酸铵钙（肥料级）中添加缩二脲、双氰胺混合标准溶液的液相色谱图

Fig.5 Liquid chromatography of mixed standard solution of biuret and dicyandiamide added to calcium ammonium nitrate (fertilizer grade)

图6 三元复混肥A中添加缩二脲、双氰胺混合标准溶液的液相色谱图

Fig.6 Liquid chromatogram of mixed standard solution of biuret and dicyandiamide added in ternary compound fertilizer A

图7 三元复混肥B中添加缩二脲、双氰胺混合标准溶液的液相色谱图

Fig.7 Liquid chromatogram of mixed standard solution of biuret and dicyandiamide added in ternary compound fertilizer B

2.3.4 实际样品检测

选取有机-无机复混肥、三元复混肥、复合肥、尿素等9批次肥料为实际样品，按样品前处理方法进行处理，平行检测2次。结果显示，9批次样品中，有2批次样品检测出双氰胺，7批次样品检测出缩二脲，具体实验检测数据见表3。9批次样品中缩二脲含量均未超过GB 38400—2019《肥料中有毒有害物质的限量要求》的限量要求。

3 结论

章明洪等^[4]发现含有酰胺键的脲基缩合物（缩三脲、N,N-亚甲基二脲）及含有硝酸根的复混肥均可能会干扰缩二脲的测定，从而限制液相色谱法的适用性。本研究通过液相色谱及紫外光谱对比分析，证明肥料配料中的肥料增效剂双氰胺会影响缩二脲含量的测定。为分离肥料中的缩二脲与双氰胺，本方法采用高效液相色谱仪配置二极管阵列检测器（Diode array detector，DAD），基于Venusil HILIC色谱技术，以乙腈水为流动相，建立了复混肥料中缩二脲与双氰胺检测方法。该方法简单高效，线性范围宽，且在正确度和稳定性方面能够满足日常检测要求。

参考文献

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(a)

(b)

(c)

�图1 缩二脲标液（a）、假阳性样品（b）、假阳性样品添加缩二脲（c）的液相色谱（左）及紫外光谱图（右）

Fig.1 Liquid chromatography (left) and ultraviolet spectra (right) of Biuret label(a), false positive sample (b), and false positive sample added biuret (c)

表1 分光光度法测定缩二脲数据结果

Table 1 Data results of biuret determination by spectrophotometry

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

图3 缩二脲和双氰胺混合标准溶液（a）、缩二脲标准溶液（b）、双氰胺标准溶液（c）、假阳性样品（d）、不含两种物质的复混肥（e）、添加双氰胺的复混肥（f）的液相色谱（左）及紫外光谱图（右）

Fig.3 Liquid chromatography (left) and ultraviolet spectra (right) of biuret and dicyandiamide mixed standard solution (a), biuret standard solution (b), dicyandiamide standard solution (c), false positive sample (d), compound fertilizer without two substances (e), compound fertilizer with dicyandiamide (f)

(f )

表2 加标回收率测定结果

Table 2 Determination results of recovery rate of standard addition

注: “—”表示未检出

表2（续）

表3 缩二脲、双氰胺测定结果

Table 3 Determination results of biuret and dicyandiamide

注: “—”表示未检出

基金项目：新疆维吾尔自治区科国际科技合作计划项目（2022E01002）

第一作者：李燕（1994—），女，汉族，新疆昌吉人，硕士，主要从事微生物检测工作，E-mail: 2575890277@qq.com

通信作者：巴哈提古丽·马那提拜（1979—），女，哈萨克族，新疆阿勒泰人，博士，高级兽医师，主要从事食品、化妆品的微生物检测和研究工作，E-mail: bahet88@163.com

1. 乌鲁木齐海关技术中心 乌鲁木齐 830063

2. 郑州海关技术中心 郑州 450008

3. 中国检验认证集团新疆有限公司 乌鲁木齐 830000

1. Urumqi Customs Technology Center, Urumqi 830063

2. Zhengzhou Customs Technology Center, Zhengzhou 450008

3. Xinjiang Central Inspection Group, Urumqi 830000