李燕 何媛 朱漪 李轲 李晓岩 徐鹏 巴哈提古丽·马那提拜

Abstract In order to determine the abundance of fungi on the surface of commonly available raisins and red dates in the market, traditional culture methodswere employed to screen three different culture media:rose bengal agar, potato dextrose agar and sabouraud dextrose agar. The growth trend of fungiwas studied, and fungal morphological structureswere observed under amicroscope. The results showed that the fungal growth of blackcurrant raisins on all three media was higher than that of other raisin varieties, and the fungal growth of Hotan red dateson three different media was also significantly higher than that of other varieties.The maximum fungal growth on the surface of raisins and red dates was observed on rose bengal agar, followed by potato dextrose agar and sabouraud dextrose agar. The fungal colonies of raisins and red dates began to grow on the culture medium from the second day, stabilizing on the fifth day with no further increase. The fungi’s morphology was further observed under the microscope. This study aims to understand the microbial abundance on the surface of different raisins and red dates, and comprehend the microbial species and their growth and culture patterns. This would assist in researching the types of microorganisms on dried fruits and improving their quality.

Keywords raisin; red date; surface fungus; abundance

水果干制品是具有独特地方特色的一种食品，其种类有红枣、葡萄干等。因干果中含有葡萄糖、维生素C、核黄素、脂肪酸、氨基酸、矿物质等多种营养物质，具有良好的口感、营养价值和药用价值，因此深受消费者喜爱^[1]。其中，用无核白鲜葡萄晾制的葡萄干，含糖量高达60%，被人们视为葡萄中的珍品。新疆红枣种植面积和产量居全国第一，是新疆林果业经济发展的重要支柱产业之一，也是新疆最具资源优势和发展潜力的食品产业^[2]，其品种有哈密大枣、阿克苏灰枣、若羌红枣、和田玉枣、喀什大枣等。葡萄干和红枣作为新疆地区的特色水果干制品，因优越的地理条件，其品质受到国际市场的认可，促进了我国新疆地区经济和国际贸易的发展。

由于晾干的葡萄干长期暴露在外部环境中，其表面含有许多泥沙、灰尘和微生物，对消费者身体健康具有一定影响^[3]。红枣在自然状态下保鲜能力较差，因而在贮藏期果实极易受微生物的感染而引起果肉腐烂变质失去商品价值。葡萄干和红枣表面微生物的数量和种类与产地、制作工艺、包装运输等诸多因素可能有关^[4]。研究发现，经短波紫外线处理的葡萄干表面真菌数量各有不同，其中黑加仑的真菌和细菌数量均多于黄提干、红提干和无核白^[5]。对宁夏红枣表面真菌进行研究，发现有7种真菌菌系，优势菌株为链格孢霉、青霉、木霉和镰刀菌，且随着贮藏时间的延长，真菌菌落数越多^[6]。有研究发现了8种在红枣表面出现的真菌，其中链格孢菌和青霉是主要菌株，链孢霉属和纸葡萄穗霉是新发现的2种真菌^[7]。Abarca等^[8]对西班牙市场上的葡萄干样品（黑加仑和其他葡萄干）进行了研究，结果显示大部分被污染的样品中均检测到了黑曲霉菌，其次是炭黑曲霉菌。

由于葡萄干和红枣表面真菌种类丰富，部分霉菌还会产生有害的次生代谢产物，如黄曲霉毒素、伏马毒、素赭曲霉毒素等，其制约了干果产业的健康发展，会对人类身体健康造成影响，是食品安全最重要的风险因子之一^[9-10]。因此，掌握对葡萄干和红枣表面的除菌杀菌技术尤为重要。本研究以市场上销售的无核白、红香妃、绿香妃、黑加仑、和田枣、哈密枣、若羌枣、灰枣、骏枣为材料，采用微生物传统检测方法研究了葡萄干和红枣表面真菌污染情况，为干果制作和储存过程中表面微生物处理控制方法提供帮助，对增强人们饮食处理安全意识和提高干果质量安全水平有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试样品

选用4种葡萄干和5种红枣进行试验，包括无核白、红香妃、绿香妃、黑加仑、和田枣、哈密枣、若羌枣、灰枣、骏枣，均购买自超市。

1.1.2 供试培养基及试剂

孟加拉红培养基（北京陆桥技术股份有限公司），马铃薯葡萄糖琼脂培养基（北京陆桥技术股份有限公司），沙氏葡萄糖琼脂培养基（北京陆桥技术股份有限公司）；乳酸石炭酸棉蓝染液（青岛海博生物技术有限公司）。采用的培养基和相关试剂均按照国家标准验收，在有效期内按要求配制和灭菌使用。

1.1.3 供试仪器及耗材

恒温培养箱、天平、均质器、恒温水浴锅、显微镜、载玻片、盖玻片、无菌接种环、培养皿等。仪器设备都通过技术性验收或计量确认，均运转正常。

1.2 试验方法

1.2.1 3种培养基分离检测干果表面真菌

参考GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物检测霉菌和酵母菌》方法^[11]对所采集的9份样品进行表面真菌检测。称取25 g样品至225 mL生理盐水中，充分振荡至杂质与表皮微生物脱落至溶液中，制成1∶10的样品匀液。吸取溶液1 mL至9 mL无菌水中，制成1∶100的样品匀液。吸取1 mL浓度为1∶10、1∶100的不同样品匀液于已标记的无菌培养皿中，将15～20 mL冷却至46℃的孟加拉红培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基，采用倾注法注入已标记的无菌平皿中，缓慢转动平皿，使平皿充分混匀，制作混菌平皿。每种样品选用以上3种培养基进行检测，不同培养基每稀释度制作3个平皿作为重复，以无菌水代替样品匀液做阴性对照，后放置于28℃恒温培养箱培养5 d，观察2～5 d真菌生长情况，测定所含真菌数量。

1.2.2 真菌形态学观察

1）菌落形态观察：选用培养第3天的真菌纯菌落，观察其菌落形态。

2）显微镜镜检：挑选每种平皿中不同颜色或不同形态的真菌菌落在孟加拉红培养基平皿上纯化，28℃培养3 d，得到单一的纯菌落。挑取分离纯化得到的真菌菌丝，采用水浸片压滴法^[12]进行显微镜观察真菌的菌丝构造、孢子的形状大小等形态结构。

1.3 数据分析

根据SPSS Statistics 19.0和Excel软件进行数据处理分析，并运用Duncan检验进行统计学多重比较。

2 结果与分析

2.1 葡萄干表面真菌在不同培养基生长量比较

表1数据显示，不同品种葡萄干在孟加拉红培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基中均能生长，但在不同的培养基中真菌数量具有显著性差异。葡萄干在同一培养基上真菌生长数量依次为黑加仑＞红香妃＞绿香妃＞无核白，黑加仑在3种不同培养基上的真菌生长量均高于其他品种的葡萄干。4种葡萄干在孟加拉红培养基中真菌生长数量最多，生长速度最快，显著优于马铃薯葡萄糖琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基（P＜0.05），为真菌最适生长培养基。其次是马铃薯葡萄糖琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，而在沙氏葡萄糖琼脂培养基上的真菌生长数量是最少的。

2.2 红枣表面真菌在不同培养基生长量比较

表2数据显示，和田大枣在3种培养基上的真菌生长量也远高于其他红枣品种。5种红枣表面真菌在孟加拉红培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基上的生长数量不同，数量差异显示为孟加拉红培养基＞马铃薯葡萄糖琼脂培养基＞沙氏葡萄糖琼脂培养基。以孟加拉红培养基上真菌数量生长最多，为真菌最适生长培养基，马铃薯葡萄糖琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基次之（P＜0.05），两者之间无显著差异性。

2.3 葡萄干真菌不同天数生长量变化

分别选择第2天、第3天、第4天、第5天进行真菌数量生长变化的统计。图1结果表明，不同品种葡萄干表面真菌在第2天开始生长，且随着培养时间的延长，真菌数量明显增加，后趋于平稳。真菌在第2天、第3天的生长速度较慢，在第3天开始，真菌生长量增加迅速，甚至长满平皿，第4天至第5天真菌生长量基本趋于稳定。

2.4 红枣真菌不同天数生长变化

由图2可见，不同品种红枣表面真菌在第2天开始生长，从第3天开始真菌生长量急剧增加，至第4天和第5天趋于稳定，不再增加。同一品种红枣表面真菌在不同培养基上生长量有明显变化。

2.5 葡萄干和红枣表面真菌的菌落形态学结果

采用倾注法对葡萄干和红枣表面真菌进行3种培养基培养，其形态结果如图3所示（此图为第4天所拍）。菌落在3种培养基上最初均呈白色，后变为灰褐色或黑褐色，且均是密集生长，快速覆盖培养基表面。在3种培养基上，菌落在孟加拉红培养基上呈黑褐色疏松形态（图3A），马铃薯葡萄糖琼脂培养基上为黑褐色稠密形态（图3B），沙氏葡萄糖琼脂培养基上呈现出灰褐色疏松形态（图3C）。

A: 孟加拉红培养基; B: 马铃薯葡萄糖琼脂培养基; C: 沙氏葡萄糖琼脂培养基

图3 干果表面真菌在3种培养基上菌落形态

Fig.3 Colony morphology of dried fruit surface fungi on three different culture media

2.6 葡萄干和红枣表面真菌的显微镜形态学结果

由图4可知，葡萄干和红枣表面真菌经显微镜观察，顶部呈蘑菇状，形态结构包含孢囊梗、囊轴、孢子囊、假根、匍匐菌丝和孢子囊孢子组成。其中，孢囊梗直立，2～4株成束，与假根对生，有时膨大或分枝，呈褐色，末端连接黑色的圆形孢子囊（图4A）。孢子囊内有囊轴，形状为球形或近球形，囊轴基部与梗相连处有囊托，囊托呈楔型（图4B）。孢子囊呈球形或近球形，无色或棕色（图4C），孢子囊里面有许多孢子，称为孢子囊孢子。菌丝之间有许多匍匐菌丝，与无分枝的长孢囊梗连接。在匍匐菌丝和孢囊梗连接处产生根样菌丝，称为假根，在假根处长出成群的孢子囊梗（图4E、4D）。孢子囊孢子呈椭圆形或球形，呈黄灰色，成熟的囊孢子从破裂的囊壁释放出来（图4F、4G）^[13-16]。

3 讨论

葡萄干和红枣的卫生项目是评价葡萄干和红枣质量是否合格的重要参考指标。本研究结果表明，不同品种的葡萄干和红枣上的真菌数量不同，这可能与加工环境和储存环境有关，且在不同培养基上的数量也存在差异性，这可能与加工过程的环境和储存环境有关。黑加仑在3种不同培养基上真菌的生长量均高于其他品种的葡萄干，达到6.2×10³ CFU/g，且葡萄干在同一培养基上真菌生长数量依次为黑加仑＞红香妃＞绿香妃＞无核白，研究差异与其他研究结果相同；和田大枣在3种培养基上的真菌生长量也远高于其他红枣品种，生长量达到2.2×10² CFU/g。葡萄干和红枣表面真菌均在孟加拉红培养基上生长量最多，其次为马铃薯葡萄糖琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基。对葡萄干和红枣的真菌生长趋势进行研究发现，两者均从第2天开始在3种培养基上有菌落生长，生长至第5天数量趋于稳定，不再增加。本研究对真菌进行形态和显微镜结构初步观察，后续有待进行分子学鉴定，确定其种属。

培养基是适合微生物生长繁殖和产生代谢产物的营养基质，任何培养基中都含有适宜微生物生长的碳源、氮源、无机盐和水，微生物在不同培养基上的生长存在很大差异^[17]。本研究选择孟加拉红、马铃薯葡萄糖琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基进行真菌培养，其真菌在3种培养基上的生长量和生长速度存在差异性。在孟加拉红培养基上菌落形态生长良好，这可能源于孟加拉红培养基中的孟加拉红成分减缓了某些霉菌因生长过快而导致菌落蔓延生长，有利于观察计数；而马铃薯葡萄糖琼脂培养基以葡萄糖作为碳源，氯霉素作为细菌抑菌剂，但氮源和无机盐的成分含量略显不足，因而使得真菌生长量低于孟加拉红培养基；沙氏葡萄糖琼脂培养基仅有葡萄糖提供碳源，动物组织的胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物提供氮源，未含有其他抑菌剂，导致菌落生长快速，蔓延整个培养皿，不便于观察菌落形态和计数。因此，在试验中培养的真菌选用适合的培养基尤为重要。

干果因其在制作加工过程中和售卖过程中，如果环境和储存方式不合适，易造成干果表面有灰尘、微生物和虫卵，严重时导致食用者身体不适，并且对销售和对外贸易经济产生影响^[18]。为了控制葡萄干表面微生物污染，提高其品质与卫生安全性，近年来对葡萄干除菌和杀菌技术的研究层出不穷，有清水清洗^[19-20]、辐照^[21]、射频杀菌^[22]、短波紫外线^[23]、超声波清洗^[24]、生物保鲜法^[25]和包装储藏^[26-27]等处理方法。在生活中常用清水清洗、焯水、高温或者使用清洗剂等处理方法对葡萄干和红枣进行销售前或食用前的处理，得到的效果不尽相同。微生物清洗试验发现，超声清洗效果显著优于普通清洗方法；使用0.1%未酸化亚氯酸钠为清洗剂，抑菌清洗效果优于10%乙醇^[28]。因此，为了食用者的身体健康，选择科学合理的处理方法很有必要。

4 结论

本研究对市场上常见的葡萄干和红枣进行表面真菌的分离检测，研究结果表明其表面真菌数量较多，但菌种单一。真菌生长量在第5天数量趋于稳定，不再增加，且在孟加拉红培养基上生长情况较马铃薯葡萄糖琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基好。综上所述，通过对葡萄干和红枣表面真菌进行研究，有利于改善干果制作和储存过程中环境和处理方式的管理，同时表明选择科学合理的控制微生物生长的方法尤为重要。

参考文献

[1]吴素玲, 孙晓明, 张峰伦, 等. 南京市场葡萄干卫生状况调查及清洗方法初探[J]. 中国野生植物资源, 2011, 30(4): 66-69.

[2]胡蝶, 熊琳, 薛雅文, 等.基于传统培养法和高通量测序技术分析新疆红枣中真菌多样性[J]. 食品安全质量检测学报, 2022, 13(24): 8101-8108.

[3]热比古丽·哈力克, 杜娟, 肯吉古丽·苏力旦. 浅析几种葡萄热风烘干后品质表现[J]. 现代园艺, 2020, 43(3): 37-38.

[4]郑永菊, 师俊玲, 刘延琳. 吐鲁番葡萄干加工中存在的主要问题[J]. 中外葡萄与葡萄酒, 2011(9): 62-64.

[5]陈存坤, 董成虎, 纪海鹏, 等. 短波紫外线处理对葡萄干表面微生物的影响[J]. 农产品加工, 2015(18): 9-11.

[6]沙月霞, 邢敏, 唐文林, 等. 红枣贮藏期病原菌系的多样性[J]. 西北农业学报, 2009, 18(2): 287-292.

[7]郝莉花, 董彩文, 陈春生, 等. 红枣贮藏期间主要病原真菌的分离、鉴定与ITS序列分析[J]. 江苏农业科学, 2016, 44(2): 304-307.

[8] Abarca M L, Accensi F, Bragulat M R, et al. Aspergillus carbonarius as the main source of ochratoxin A contamination in dried vine fruits fromthe Spanish market[J]. Journal of Food Protection, 2003, 66(3): 504-506.

[9]沈友明, 聂继云, 李志霞, 等. 果品中真菌毒素的污染、毒性、生物合成及影响因素研究进展[J]. 食品科学, 2018, 39(9): 294-304.

[10]谢汉忠, 黄玉南, 李君, 等. 葡萄及其制品中真菌毒素研究进展[J]. 农学学报, 2017, 7(12): 70-75.

[11] GB 4789.15—2016 食品国家标准 食品微生物检测 霉菌和酵母计数 [S].

[12]蔡信之, 黄君红. 微生物学实验[M]. 北京: 科学出版社, 2009: 37-38.

[13] Zheng R Y, Chen G Q, Huang H, et al. A monograph of Rhizopus[J]. Sydowia, 2007, 59(2): 273-372.

[14]陈江华, 王轩轩, 崔雪婧, 等. 柑橘根霉软腐病的病原菌分离与鉴定[J]. 植物病理学报, 2020, 50(3): 255-260.

[15]南小华, 李牧, 陈福生. 高产糖化酶根霉菌株的筛选、鉴定及其在孝感米酒中的应用[J]. 中国酿造, 2018, 37(9): 88-93.

[16] Schipper M A A, Stalpers J A. A revision of the genus Rhizopus.II.The Rhizopus microsporus-group[J]. Studies in Mycology, 1984, 25: 20-34.

[17]范盈盈, 王富兰, 王帅, 等. 红枣黑斑病链格孢属真菌的生物学特性[J]. 西北农业学报, 2020, 29(12): 1913-1921.

[18]汤梦婷. 葡萄干表面霉菌菌群分析及清洗方法研究[D]. 合肥: 安徽农业大学, 2021.

[19]沙娜瓦尔·色买提. 新疆干枣主要病害病原分析及物理防控技术探索[D]. 乌鲁木齐: 新疆农业大学, 2016.

[20]李忠新, 杨军, 韩小军, 等. 6QX-800型气泡式干果清洗机的研制[J]. 新疆农机化, 2007(6): 37-38.

[21]古明亮, 张朝林, 陈鹏月, 等. 电子束辐照对无核葡萄干的杀灭霉菌效果及感官品质的影响[J]. 江苏调味副食品, 2020(1): 41-44.

[22]樊荣. 葡萄干射频杀菌技术研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2019.

[23]董成虎, 韩洁, 陈存坤, 等. 短波紫外线和臭氧处理对葡萄干表面霉菌及品质的影响[J]. 保鲜与加工, 2015, 15(6): 39-42.

[24]刘伟, 宋弋, 廖小军, 等. 超声波技术在果蔬采后贮藏保鲜中的研究进展[J]. 食品研究与开发, 2017, 38(23): 206-216.

[25]陈燕. 一氧化氮熏蒸对干果贮期病害抑制及毒素清除作用的研究[D]. 乌鲁木齐: 新疆大学, 2020.

[26]丁卫英, 张江宁, 张玲, 等. 包装方式对灰枣品质的影响[J].农产品加工, 2016(24): 12-14.

[27]迟岩. 干制灰枣贮藏褐变控制技术的研究与应用[D]. 乌鲁木齐: 新疆农业大学, 2021.

[28]智颉. 无核白葡萄干无水清洗工艺的研究[D]. 乌鲁木齐: 新疆农业大学, 2018.

表1 葡萄干表面真菌在不同培养基上生长量比较

Table 1 Comparison of fungal growth on raisin surface in different culture media

注: a、b表示在P＜0.05条件下存在显著差异

表2 红枣表面真菌在不同培养基中生长量比较

Table 2 Comparison of fungal growth on red date surface in different culture media

注: a、b表示在P＜0.05条件下存在显著差异

孟加拉红培养基马铃薯; 葡萄糖琼脂培养基; 沙氏葡萄糖琼脂培养基

图1 不同天数葡萄干真菌生长量变化

Fig.1 Variation in fungal growth on raisins over different days

孟加拉红培养基马铃薯; 葡萄糖琼脂培养基; 沙氏葡萄糖琼脂培养基

图2 不同天数红枣真菌生长量变化

Fig.2 Variation in fungal growth on red dates over different days

A: 孢囊梗 B: 囊托 C: 孢子囊 D: 假根 E: 匍匐菌丝 F-G: 孢子囊孢子

图4 显微镜下真菌形态结构

Fig.4 Fungal morphological structure under microscope