王艺凯 孔维恒 杨帆 邱烨 杨菲 杜智欣 李云鹏 刘鑫

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）体外基因扩增技术最早兴起于20世纪80年代，随后得到快速发展。该技术的原理是使用特异性的引物可以将靶标基因在短时间内快速扩增上百万倍，产生大量的靶标基因扩增产物，通过电泳或者读取荧光信号的方式快速鉴别靶标基因^[1-3]。生物重大公共卫生事件对经济发展会造成严重威胁，及时了解和遏制生物安全事件传播路径以及模式对制定相应有效的防控策略起到了至关重要的作用，及早发现并进行病原的管控是快速控制该类事件的有效方法，因此国家要求县区级以上疾控中心与二级以上医院都需具备核酸检测的能力。目前，我国的分子诊断实验室数量由2000多家上升至12000余家。保障分子诊断实验室的检验准确高效是遏制疫情传播的基石。随着对PCR技术的不断改进和优化，层出不穷的扩增检测技术被开发应用，如毛细管电泳技术^[4]、实时荧光定量PCR技术^[5]、数字PCR技术^[6]等都已经应用到分子诊断实验室中。PCR技术一旦操作失误出现扩增产物的外溢导致污染，由于PCR技术超高的灵敏度，如果不进行及时的控制与清除，便会导致核酸检测出现假阳性，阴性质控失效，检测结果无法判读^[7-8]。因此，核酸气溶胶污染是PCR试验难以避免的问题。

1 核酸气溶胶简介

气溶胶是指固体或液体颗粒物均匀地分散在气体中形成的相对稳定的悬浮体系，其中气体介质为连续相，空气及固态或液态颗粒为分散相。气溶胶颗粒大小在0.01～10 μm之间。气溶胶的来源和形成原因会导致较大的粒径差异，例如：生物气溶胶是由生物来源的颗粒形成的气溶胶，颗粒通常包含微生物或者生物大分子，大量可培养的细菌和真菌生物气溶胶集中在＜3.3 μm，其在实验室受到格外关注最早是因为生物安全问题。Pike等^[9-10]对3921例实验室相关感染分析发现，不明原因的实验室感染高达82%，大部分学者认为这些不明原因的实验室感染与病原微生物形成的感染性气溶胶在空气中扩散有关。实验室报道至少有2例莱姆病临床致死的原因可以归结于核酸气溶胶污染导致的PCR假阳性^[11-13]，杜茜等^[14]通过实验验证了日常实验室操作中离心操作、吹打混匀、高浓度微生物培养器皿破裂都会产生病原微生物气溶胶。

同样，在实验室样本吹打混匀、离心、加样、高通量核酸提取过程中也可能出现含有核酸的气溶胶液体微滴，即核酸气溶胶。尤其是猪瘟病毒检测或者新冠病毒第三方核酸检测实验室，单次的PCR反应产物能产生多达10⁹拷贝数的靶序列扩增产物，这些扩增产物因操作原因产生核酸气溶胶，气溶胶微滴会含有10⁶以上的拷贝数，核酸气溶胶微滴通过空气循环系统污染整个分子诊断实验室。核酸气溶胶虽不像病原微生物气溶胶对试验人员的生命安全构成威胁，但是为实验室的质量控制和结果分析带来较大干扰^[15-16]，同时这些核酸气溶胶还会扩散累积至整个实验室的试剂、设备和耗材表面，残留在通风系统内部难以祛除^[17-18]。核酸气溶胶污染的清除效率的高低预示着实验室恢复正常工作的进程快慢，因此需要开发出一种高效清除核酸气溶胶污染的解决方案。

2 分子诊断实验室气溶胶污染的解决方法

目前分子诊断实验室常见的有以下几种核酸污染原因：高浓度样本的污染（阳性质粒或高浓度基因组的气溶胶污染）、样本处理时样本间的交叉污染（多来源于气溶胶污染）、扩增目的片段污染（高浓度扩增产物外溢及气溶胶污染）、人员污染（操作人员未严格按照实验室规定流向流动，触碰核酸污染物后接触其他洁净区域或洁净物料、耗材）^[19-21]。其中，物体表面的污染物尚可通过核酸酶、核酸清除剂、次氯酸盐等试剂直接喷洒擦拭处理，再结合长时间紫外照射后通风高效清除核酸污染，但核酸气溶胶的清除目前是核酸污染处理中的难点，大部分实验室只能通过紫外消毒结合长时间通风的方式进行有限的核酸气溶胶清除，效率低，清除时间久^[22]。针对空气中的气溶胶污染，很多实验室会选择向空气中喷洒乙醇然后配合次氯酸消毒液处理地面^[7]。这些方法各有优劣势，本文进行了详细的介绍。

2.1 高压灭菌配合紫外消毒清除

高压灭菌锅以及紫外灯是实验室常用设备，但研究紫外线对于核酸降解效率的报道不一，郭灵安等^[22]研究在使用8 W，辐照强度为60 μW/cm²的紫外线灯对小于300 bp的核酸污染物近距离（50 cm）照射6 h的情况下，核酸污染物并没有被完全清除，且不会随着紫外线时间延长而被完全清除。还有研究者将核酸污染的耗材进行高压灭菌（128℃，420 min）后再次干燥，暴露于10～60 J/（cm²·d）紫外光照射下发现可以清除大部分核酸污染，就小于200 bp的脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）片段而言，高压灭菌比紫外线照射清除效率更高。但在实验室实际应用中，高压灭菌对于耗材有较大的选择性，同时针对长片段如质粒、基因组核酸，高压灭菌的核酸清除效果有限；而紫外线只能诱导核酸中的嘧啶产生二聚体，并不能使核酸发生降解或者断裂，因此紫外消毒清除核酸气溶胶效果不如高压灭菌^[23-24]。目前，分子实验室最通常的做法是多次高压灭菌结合长时间紫外线消毒进行核酸气溶胶的污染清除，该方案操作简单，但相对耗时，同时只能针对物品或者耗材，无法对空气核酸气溶胶以及物表进行有效清除。

2.2 环氧乙烷消毒清除

环氧乙烷（Ethylene Oxide，EO）在常温下为气态，负压下对灭菌物品的穿透性极强，可以透过包装进入灭菌物品的内部，因此具有优异的杀菌性能，作为一种广谱杀菌方式，可以高效杀灭细菌、病毒、芽孢等绝大多数微生物。环氧乙烷可以与微生物的蛋白、DNA以及核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）发生非特异性烷基化作用而使蛋白质失活导致微生物的死亡。由于DNA的结构中含有大量的氨基与羟基，环氧乙烷在灭菌过程中可以与氨基、羟基发生烷基化作用，灭菌完成后，DNA基本结构的形状虽然没有改变，但是DNA在环氧乙烷的作用下生成了带有羟乙基的化合物，因此在PCR扩增中无法完成退火结合引物，延伸时也不能结合脱氧核糖核苷酸底物。同时，由于羟乙基化合物的结构相对稳定，导致DNA的羟乙基化是不可逆的，这种灭菌方式虽然无法降解核酸，但是也大大减小了核酸污染对于PCR扩增检测的影响。无菌医疗产品通常也会使用环氧乙烷气体来灭菌，经过3 h的EO处理可以使PCR扩增产物减少10⁴个数量级^[25]。这种核酸污染清除的方式相对于高压以及紫外灭菌更加有效，但是经过EO作用后会伴有副产物的残留，而一次性医疗用品的环氧乙烷残留应≤10 μg/g，需要经过一段时间的通风解析。但EO具有易燃易爆的性质，同时还是一种可疑致癌物，使得在分子诊断实验室中配备的环氧乙烷灭菌设备的安全性还需要进一步研究论证。

2.3 消毒剂清除

实验室常用的化学消毒剂种类多样，一般包括含氯消毒剂、过氧化物类消毒剂、醇类消毒剂、季铵盐类消毒剂以及醛类消毒剂^[26]。刘军权^[27]在使用上述不同类的消毒剂进行实验室内部乙肝病毒基因（Hepatitis B，HBV-DNA）的核酸清除研究中发现，含氯消毒剂清除实验室核酸污染效果最优^[28]，过氧乙酸和戊二醛溶液不易作为常规清除实验室外源性HBV-DNA污染的方法。美国疾控中心针对实验室核酸污染清除给出的指导意见也是采用商品化核酸清除试剂或者次氯酸溶液处理固体表面，84消毒液的主要成分为次氯酸，利用其强氧化性的特点可以与DNA、RNA发生氧化反应，破坏核酸的基础结构，从而达到降解核酸的目的^[24]。但在实际应用中，由于其化学性质不稳定、腐蚀性大、易挥发，限制了其在实验室中的应用^[29]。

2.4 核酸清除剂

市售核酸清除剂种类较多，按作用原理大致分为以下几类：物理吸附、酸碱中和、核酸酶酶解作用、化学氧化作用^[30-34]。物理吸附型核酸清除剂与核酸并未发生化学反应而是与核酸形成不溶复合物沉淀，以此消除核酸残留造成的影响。这类物理吸附型清除剂由于其中性酸碱度（Potential of hydrogen，pH）以及无腐蚀性的特点也可以用于核酸气溶胶污染的清除。也有研究表明，虽然单纯依靠物理吸附型核酸清除剂无法达到完全清除核酸气溶胶，但是可以依靠其对于空气中的气溶胶有较好的沉降效果这一优势，再结合84消毒液高效的物体表面核酸清除能力匹配使用，以彻底清除核酸残留。酸碱中和类核酸清除剂一般分为A/B液，先进行碱液喷洒擦拭，核糖核酸含有2’-OH，在强碱的作用下会形成不稳定的磷酸三酯，随即水解产生2’-核苷酸和3’-核苷酸被降解，再使用酸液中和碱液减少对物表腐蚀作用，其使用范围与消毒剂类似，但由于其本身具有强碱腐蚀性，在实验室的应用中具有较大的限制性，而且此类核酸清除剂对于DNA的清除效果有限，因为DNA并不含有2’-OH，所以不能形成碱水解的中间产物。核酸酶酶解作用类核酸清除试剂的清除效果强，按作用底物来分可以分为核糖核酸酶以及脱氧核糖核酸酶，分别作用于RNA及DNA。核酸酶类清除剂相较于化学消毒剂的核酸清除效果相当，且由于其缓冲体系为中性的作用条件，适用于易腐蚀的材料，但清除完成后需要进行残留核酸酶的清除以避免对其他分子实验造成干扰，增大了实验室的工作量，同时核酸酶类的试剂有低温的保存条件要求，使用以及保存的成本都相对较高，且应用于空气气溶胶消毒的案例目前尚未见报道。目前化学氧化作用类核酸清除剂国内外皆有商业化产品^[35-36]。仪器将核酸清除试剂雾化成纳微米级别的微滴分散到空气中，微滴在布朗运动的作用下能够与核酸气溶胶发生接触，从而对空气中的核酸气溶胶进行降解。整套清除系统对核酸气溶胶污染有良好的清除效率，在常规情况下，清除时间达到1 h以上即可满足要求，可以高效清除空气中气溶胶核酸污染。与其他三类核酸清除剂相比，该类产品无腐蚀性，对长短片段的核酸降解效率高，价格低廉，更适用于实验室复杂条件下的核酸污染清除。

在分子实验室实际的工作中，实验室人员发现核酸实验室污染后应立即停用，并且立即定位污染源，再根据实验室污染情况进行具体分析，对应使用不同的清除方法，达到快速有效清除实验室污染的目的^[37-39]。清除污染源后再次验证污染情况，直到能重新启用实验室。

3 未来的展望

随着核酸检测技术的日趋成熟，分子诊断实验室数量的不断增加，实验室发生PCR核酸污染的风险也会相应存在，为了防止假阳性或者假阴性的情况出现影响实验室的正常运行，除了按照实验室已有的管理体系外，还需要进行定期的核酸污染检测。对易发生污染的台面、桌面、离心机、安全柜、提取仪、冰箱、门把手等位置定期采用拭子表面采样，对实验室各个分区的空气采用沉降法进行定期采样，发现污染源后即可有针对性地进行污染清除。对于物表的核酸污染，可以采用核酸清除剂以及含氯消毒剂进行清除，对于气溶胶的污染可以使用核酸清除剂配合核酸气溶胶清除仪进行有效清除，再辅助以紫外消毒和定期的通风，保证实验室环境和设备的清洁。除了以上技术手段，目前还有人工核酸酶的研发正在进行，人工核酸酶主要是使用金属配合物通过水解和氧化促进核酸降解，如锌指核酸酶、CRISPR/Cas系统^[40]。但是人工核酸酶的应用场景主要还是在体内，目前成本较高，出于经济性考虑难以用于实验室日常使用，假以时日，人工核酸酶能够降低成本进行商业化批量生产，结合气溶胶消毒技术，一定能够开发出更为高效、便捷、经济的核酸气溶胶清除解决方案^[41]。分子诊断实验室核酸气溶胶污染防大于除，一旦发生核酸泄漏，污染范围便会迅速扩大，彼时再去寻找污染源便会费时费力，因此养成良好的实验室习惯，防止污染的发生尤为重要。

参考文献

[1] Michael, W, Pfaffl. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR[J]. Nucleic Acids Research, 2001.

[2] 朱永芳. 实时荧光聚合酶链式反应检测技术[M]. 北京: 中国计量出版社, 2103．

[3] 郭利华. PCR实验室的污染及控制措施[J]. 国际检验医学杂志, 2016, 37(16): 2354-2355.

[4] BjoRheim J, Minarik M, Gaudernack G, et al. Evaluation of denaturing conditions in analysis of DNA variants applied to multi-capillary electrophoresis instruments[J]. Journal of Separation Science, 2015, 26(12-13): 1163-1168.

[5] Gibson U E, Heid C A, Williams P M. A novel method for real- time quantitative RT-PCR[J]. Genome Research, 1996, 6(10): 995.

[6] High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number[J]. Analytical Chemistry, 2011, 83(22): 8604-8610.

[7] 毕承恩, 瞿文金, 郑丽娟, 等. 核酸实验室污染原因及处理[J]. 临床血液学杂志, 2017, 30(2): 135-137.

[8] 颜秀娟,邱昌文,石庆秋, 等.核酸血液筛查污染控制措施[J]. 中国输血杂志, 2012, 25(8): 807-808.

[9] Pike Ｒ M. Past and present hazard of working with infectious agents[J]. ARCHIVES OF PATHOLOGY & LABORATORY MEDICINE, 1978, 102(7) : 333-336．

[10] Pike R M. Laboratory-associated infections: incidence, fatalities, causes and prevention[J]. Annual Review of Microbiology, 1979, 33: 41-66.

[11] Persing D H. Polymerase chain reaction: trenches to benches[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1991, 29(7): 1281-1285.

[12] Molloy P J, Persing D H, Berardi V P. False-positive results of PCR testing for Lyme disease[J]. Clinical Infectious Diseases,  2001, 33(3): 412-413.

[13] Robin P, Grogg K L, Edwards W D, et al. Death from Inappropriate Therapy for Lyme Disease[J]. Clinical Infectious Diseases, 2000(4): 1107-1109.

[14] 杜茜, 王洪宝, 刘克洋, 等. 病原微生物实验室实验操作产生气溶胶风险定量研究[J]. 军事医学, 2015, 39(12): 926-928+933.

[15] 钟宏文, 朱丽康, 温晓静,等. 基层医院新型冠状病毒核酸检测与生物安全防护探讨[J]. 检验检疫学刊, 2020, 30(5):120-122+125.

[16] 吴洪敏, 刘明星, 刘璇, 等. 某新冠肺炎定点医院环境气溶胶SARS-CoV-2核酸检测结果[J]. 中华医院感染学杂志, 2022, 32(9): 1426-1429.

[17] MORONO, Yuki, et al. Assessment of capacity to capture DNA aerosols by clean filters for molecular biology experiments[J]. Microbes and environments, 2018, 33(2): 222-226.

[18] QIAO, Yuechen, et al. Wind tunnel-based testing of a photoelectrochemical oxidative filter‐based air purification unit in coronavirus and influenza aerosol removal and inactivation[J]. Indoor air, 2021, 31.6: 2058-2069.

[19] 石浩宇, 刘毅, 范鹏程. PCR实验室核酸污染监测及排除[J].中国医疗器械信息, 2018, 24(7): 25-26+36.

[20] 王颖. PCR试验污染问题分析与对策[J]. 实用医技杂志, 2003(5): 454-455.

[21] 姚远, 张国富, 刘玉英. PCR污染与对策及假阴性原因[J]. 实用医技杂志, 2002, 9(4): 276-277.

[22] 郭灵安, 雷绍荣, 宋君. 紫外线清除实验室转基因物质污染的效果研究[J]. 中国消毒学杂志, 2015, 32(5): 437-439.

[23] Aslanzadeh J. Preventing PCR amplification carryover contamination in a clinical laboratory[J]. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2004, 34(4): 389-396.

[24] Ying Zhang, Jianguo Zhou, Haitao Zhu, et al. Effectiveness of different disinfectants and combinations against SARS-CoV-2 nucleic acid in COVID-19 quarantine wards[D]. 2023 .

[25] 韩海军, 张玉红, 贾东涛, 等.环氧乙烷消杀DNA污染效果初探[J].中国法医学杂志, 2018, 33(1): 47-50.

[26] 刘军权, 周燏. 不同消毒方法对试验操作台HBV-DNA清除方法比较[J]. 中华医院感染学杂志, 2013, 23(1): 121-123.

[27] 刘军权, 周忠海, 陈复兴．紫外线照射消除PCR技术外源性HBV-DNA污染作用观察[J]. 解放军检验医学杂志, 2002, 1(2): 161-162.

[28] S Stoufer, M Demokritou, D Buckley, et al. Evaluation of the ability of commercial disinfectants to degrade free nucleic acid commonly targeted using molecular diagnostics[J]. Journal of Hospital Infection, 2023, 133: 28-37.

[29] 王哲, 秦怡璠, 王一萍, 等. 分子诊断实验室核酸污染清除方法研究[J]. 顺德职业技术学院学报, 2022, 20(2): 5-9.

[30] 李云龙, 张健, 魏艳秋, 等. 分子诊断实验室去除核酸污染的方法学研究[J]. 生物工程学报, 2021, 37(2): 673-679.

[31] 洪泽龙, 张奕珊, 朱凯跃, 等. 实验室病毒核酸检测的气溶胶污染问题与对策[J]. 养禽与禽病防治, 2022(3): 17-19.

[32] Esser K H , Marx W H , Lisowsky T. DNA decontamination: DNA-Exitus Plus in comparison with conventional reagents[J]. BioTechniques, 2006, 40(2): 238-239.

[33] Borst A , Box A T A , Fluit A C. False-Positive Results and Contamination in Nucleic Acid Amplification Assays: Suggestions for a Prevent and Destroy Strategy[J]. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 2004, 23(4): 289-299.

[34] 周志图. 一种消除空气中核酸气溶胶污染的试剂及方法: CN111183978A[P]. 2020.

[35] Melina F, Nathalie R, Thür Barbara, et al. Efficacy Assessment of Nucleic Acid Decontamination Reagents Used in Molecular Diagnostic Laboratories[J]. PLoS ONE, 2016, 11(7): e0159274. DOI: 10.1371/journal.pone.0159274

[36] Yka B, Sheng L, Ng A. Evaluation of different cleaning strategies for different types of forward osmosis membrane fouling and scaling[J]. Journal of Membrane Science, 2022, 596(C). DOI: 10.1016/j.memsci.2019.117731.

[37] 王爽, 潘阳, 徐新民, 等. 新型冠状病毒核酸PCR检测假阳性核酸污染类型的鉴别方法[J]. 首都医科大学学报, 2022, 43(3): 427-432.

[38] 龚文娟, 陈宝荣, 孙慧颖, 等. 新型冠状病毒核酸检测阳性质控品污染原因分析及解决办法[J]. 中华临床实验室管理电子杂志, 2021, 9(4): 237-241.

[39] 李晓丽, 董佳慧, 吉鸿超, 等. 一起核酸实验室污染的调查与处理[J]. 中国畜牧兽医文摘, 2018, 34(1): 66.

[40] Zhen, Cowan, J. A . Metal complexes promoting catalytic cleavage of nucleic acids-biochemical tools and therapeutics[J]. CURRENT OPINION IN CHEMICAL BIOLOGY, 2018. DOI:10.1016/j.cbpa.2017.10.029.

[41] Alan Beswick, Jodi Brookes. Room-Based Assessment of Mobile Air Cleaning Devices Using a Bioaerosol Challenge[J]. Applied Biosafety, Mar 2023(3): 1-10.

Abstract In vitro diagnostic reagents and scientific research reagents based on polymerase chain reaction have been widely used in molecular diagnostic laboratories in fields such as customs, hospitals, disease prevention and control center, forensics medicine. However, due to their susceptibility to nucleic acid aerosol contamination during operation, false positive results affect laboratory work. This paper compared several nucleic acid aerosol removal methods commonly used in laboratories, and proposed solutions for nucleic acid contamination monitoring and post-discovery clearance in molecular diagnostic laboratories.

Keywords nucleic acid aerosols; molecular diagnostics; polymerase chain reaction