郭思言 张文华 张晓燕 郑文 景渝 李晓华 程妮郦 何梦婷

Abstract An ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole / electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry ( UPLC-Q-Orbitrap HRMS ) method was established for the qualitative confirmation and quantitative analysis of U series new synthetic opioids in health foods. Standard compounds were dissolved and diluted in 0.1% formic acid-acetonitrile solution. A comprehensive approach combining full scan and data-dependent MS/MS scans was employed to establish a library of fragmentation spectra, isotopic distributions, and precursor-to-product ion ratios for the compounds of interest. the qualitative confirmation of various U-series new synthetic opioid substances was achieved. The optimized chromatographic and mass spectrometry conditions were used for quasi quantitative analysis of the analyte. The samples were extracted with 0.1% formic acid-acetonitrile, purified by dispersive solid-phase extraction and analyzed by instrument. By comparing the information with compound libraries such as standard spectra, the qualitative confirmation of U-series novel synthetic opiates was achieved. Additionally, accurate quantification of target analytes was accomplished using optimized chromatographic and mass spectrometric conditions. The method exhibited that the limits of detection were 30 μg/kg, 15 μg/kg, 3 μg/L, and 15 μg/L and the limits of quantification were 80 μg/kg, 40 μg/kg, 8 μg/L, and 40 μg/L for health products with matrices including tablets, powdered tea, beverages, and syrups, respectively. The average recovery rates ranged from 68.2% to 95.4%, with relative standard deviations ranging from 1.6% to 9.8%. Overall, this method enables rapid qualitative and quantitative analysis of U-series novel synthetic opiates in samples.

Keywords U series novel synthetic opioids; health food; rapid screening; high-resolution mass spectrometry

新精神活性物质（new psychoactive substances，NPS）是指没有被《1961年麻醉品单一公约》和《1971年精神药品公约》列管，但具有滥用潜力，可以引起公共健康风险的精神活性物质，已成为继传统毒品、合成毒品后全球流行的第三代毒品^[1-4]。由于其化学结构可以人为设计与合成，截至2019年已达950余种，其更新和研制速度迅速，严重威胁着公共卫生秩序和人类健康^[5]。自2017年以来，我国对部分U系列化合物新精神活性物质进行管控，将U-47700等列入《非药用类麻醉药品和精神药品管制品种增补目录》^[6]。U系列化合物是合成阿片类物质的一个重要亚类^[7]。目前有报道的U系列化合物包括U-50488、U-62066、U-48800、U-47700、U-49900等，由于全球对芬太尼类物质管制力度的加强，从2019年5月1日开始，我国对芬太尼类物质实行了整类列管^[6]。因此U系列化合物可能逐步成为毒品消费市场新的流行趋势，新精神活性物质极有可能被伪装成各类保健食品流入二级市场，因此，开展保健食品中U系列新型精神活性物质的检测研究也应得到重视。

当前，检测U系列化合物的方法有气相色谱-质谱联用法和超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱法^[8-9]。钱振华等^[8]分别在电子轰击源和电喷雾正离子模式下采集数据，对U系列化合物碎片离子进行解析，提供了一种鉴定该化合物的思路。但国内外文献对其在食品中的鉴定及含量分析报道较少，目前国内外对新精神活性物质的研究多数集中于如尿液、血液、发丝等生物样品测定^[9-10]。近期，有部分学者开始对城市生活污水中新精神活性物质及其代谢物进行检测^[11-13]，或利用高分辨质谱结合核磁共振的技术进行定性鉴别^[14-15]。

本文建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱对U系列新型合成阿片类物质在保健食品中的筛查和定量方法，通过采集样品全扫描-自动触发二级扫描数据图，构建二级质谱数据库，建立了4种不同基质的保健食品中非靶向快速检测该类化合物的方法，并通过碎片离子信息推测该类化合物的断裂特点，找到碎裂规律，通过优化前处理方法对该类化合物在4种基质中进行准确定量，为今后该类物质的整类管控及为该类物质在保健食品中的监控提供思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

标准品U-47700、U-49900、U-48800、MD-U-47700、N-Methyl U-47931E购自上海原思标物科技有限公司，纯度≥95%；乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱纯）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，无水硫酸镁（分析纯）购自成都市科隆化学品有限公司，乙酸铵（色谱纯）购自美国ACS公司，保健品样品来自入境检测样品及跨境电商；十八烷基硅烷粉（C₁₈）购自Bepure公司，PSA购自美国Supelco公司。

标准品用甲醇溶解配制成1000 mg/L标准储备溶液，4℃冰箱避光保存。根据实际分析按要求用0.1%甲酸乙腈溶液稀释成不同浓度的标准工作液。

1.2 仪器设备

Dionex 3000超高效液相色谱仪、Thermo Scientific Q Exactive高分辨质谱仪安装Trace Finder 3.0处理软件（美国Thermo Fisher Scientific公司）；ELGA-Q15高纯水发生器（英国ELGA公司）；3-30K离心机（德国Sigma公司）；AS系列超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；涡旋混合器（美国Scilogex公司）。

1.3 样品前处理

片剂、茶粉样品：称取0.5 g（精确到0.01 g）样品于50 mL具塞离心管中，加入20 mL 0.1%甲酸乙腈，超声提取10 min，在8000 r/min下离心3 min，准确移取2 mL上清液，加入750 mg无水硫酸镁，150 mg PSA，80 mg C₁₈粉末，20 mg GCB（色素含量低的浅色片剂不加），涡旋混匀3 min，在8000 r/min下离心3 min，取上清液过0.22 μm滤膜后供仪器分析。

饮料、糖浆样品：准确量取10.0 mL样品于50 mL具塞离心管中，加入2 g氯化钠，加入0.1%甲酸乙腈，20 mL，超声提取10 min，在8000 r/min下离心3 min，准确移取2 mL上清液，加入450 mg无水硫酸镁，35 mg PSA，15 mg C₁₈粉末，涡旋混匀3 min，取上清液过0.22 μm滤膜后供仪器分析。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

使用Thermo Hypersil GOLD C₁₈色谱柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm），流动相A为乙腈，流动相B为2 mmol/L乙酸铵溶液（0.1%甲酸），流速为0.30 mL/min，柱温为25°C，进样体积为20 μL，分析时间为10 min，液相色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

Table 1 Liquid chromatography gradient elution procedure

1.4.2 质谱条件

1）筛查分析

电喷雾离子（ESI）源，正离子模式；扫描方式：全扫描-自动触发二级扫描（full MS-ddMS²）；毛细管温度：350℃；鞘气（N₂）流速：40 L/min；辅助气（N₂）流速：10 L/min；吹扫气（N₂）流速：3 L/min；喷雾电压：3 kV；最大驻留时间（Maximum IT）：50 ms；扫描范围：m/z 100～1000；Top N：5；分离窗口：m/z 4.0；碰撞能量：40 eV；碰撞能量步进值：50%；阈值触发值：1×10⁵；顶点触发时间：2～8 s；动态排除时间：10 s。

2）定量分析

电喷雾离子（ESI）源，正离子模式；扫描方式：多反应二级扫描（PRM）；毛细管温度：350℃；鞘气（N₂）流速：40 L/min；辅助气（N₂）流速：10 L/min；吹扫气（N₂）流速：3 L/min；喷雾电压：3 kV；最大驻留时间（Maximum IT）：100 ms。

2 结果与讨论

2.1 非定向筛查方法的建立

非定向筛查方法主要应用于暂时无法利用获取标准品或是对未知物种类数量无法确定的情况，可根据现有的数据库来进行识别风险化合物，进行定性确证^[16]。本文利用高分辨质谱可自动触发进行二级质谱碎裂的特性，第一步是建立高分辨数据筛查库，将100 μg/L混合标准品溶液用确定的色谱质谱条件进样分析，采用全扫描-自动触发二级扫描模式采集U系列化合物的质谱信息，获取分子离子、碎片离子精确质量数，保留时间等基础参数，平行进样6次，以确保数据库的重现性与准确性，将信息导入数据库中，同时将不同能级质谱信息叠加后得到的标准物质裂解离子谱图，导入二级谱图库中，通过完善化合物名称、分子式、扫描方式、化合物类别等信息，建立化合物数据库。第二步是将标液和样品利用筛查分析的色谱质谱条件进样后，利用Trace Finder 3.0处理软件对数据进行筛查处理。为保证化合物能通过数据库匹配同时降低假阳性概率，优化设置的母离子及子离子精确质量数偏差为5 ppm，至少匹配子离子个数为2，同位素丰度相似度90%，保留时间差不大于0.5 min，谱图相似度比设置不小于0.60，除母离子质荷比通过外，另外2个及以上参数符合条件即视为筛查比对通过（界面Flag显示绿灯），判断该样品为阳性。通过向空白片剂、茶粉、饮料、糖浆中添加不同浓度的标液以确定通过筛查比对的检出限分别为30 μg/kg、15 μg/kg、3 μg/L和15 μg/L，阳性样品通过后续实验进一步定量分析，通过与标液的保留时间、特征二级碎片离子的再次比较，对样品再次验证并进行准确定量。

建立的5种U系列新型精神活性物质的化合物名称、理论精确分子量、碎片离子信息、化学结构式等参数如表2所示。

2.2 条件的优化和方法学验证

2.2.1 提取溶剂的优化

分别采用甲醇、乙腈、酸性乙腈、乙腈水溶液样品进行提取，按照前处理步骤分析进样。结果表明，采用0.1%甲酸乙腈作为提取溶剂时方法的检出限较低，化合物回收率较好，因此，选取0.1%甲酸乙腈作为分析时的提取溶剂，不同提取溶剂对U系列新型合成阿片类物质的回收率如图1所示。

2.2.2 定量分析净化剂的优化

前处理采用酸性乙腈提取后加入适量净化剂进行净化，由于QuEChERS法处理快速且净化效果较好，因此采用分散固相萃取对样品进行净化。在分别对除水剂和净化剂的选择过程中发现，无水硫酸镁作为除水剂时各化合物的回收率均较高，采取正交分组方式考察不同净化剂的量对待测物回收率的影响，净化剂正交分组见表3。在片剂和茶粉基质中添加100 μg/kg标液、饮料及糖浆中添加50 μg/L标液，平行测定3次。各化合物在不同基质中的平均回收率见表4～7。结果表明，C₁₈和PSA作为净化剂可去除大部分干扰物质，且发现PSA和C₁₈适量增加可以提高化合物回收率，GCB可以去除色素和其他脂类化合物，发现当PSA为150 mg，C₁₈粉末为80 mg，GCB为20 mg时，茶粉和片剂样品中各化合物回收率相比其他组合较好。GCB能够降低茶粉和片剂中的色素和脂类等部分干扰物质，因此使用150 mg PSA、80 mg C₁₈粉末、20 mg GCB作为最优条件对茶粉和片剂样品进行净化。对于饮料和糖浆，加入GCB对各化合物的回收率没有显著影响，加入量过大时回收率显示有所下降，因此使用450 mg无水硫酸镁、35 mg PSA、15 mg C₁₈粉末对饮料和糖浆进行净化时，各化合物的回收率较好。

表3 不同分组的净化剂含量组合情况

Table 3 Combination of purification agent content by different groups

2.2.3 线性范围和定量限

配制浓度范围为1～200 μg/L的混合标准溶液，用建立好的定量分析方法进样分析，以各物质的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标建立标准曲线。如表8所示，5种化合物在各自的范围内线性关系良好，R²均大于等于0.99。以大于等于3倍信噪比（S/N≥3）确定检出限（LOD），以大于等于10倍信噪比（S/N≥10）确定定量限（LOQ），片剂、茶粉、饮料、糖浆中U系列新型合成阿片类物质的检出限分别为30 μg/kg、15 μg/kg、3 μg/L和15 μg/L，定量限分别为80 μg/kg、40 μg/kg、8 μg/L和40 μg/L。

表8 5种U系列新型合成阿片类物质的线性方程及相关系数

Table 8 Linear equations and correlation coefficients of five U series new synthetic opioids

2.3.4 回收率和精密度

通过加标实验测试该方法对U系列新型合成阿片类物质的检测回收率，在片剂样品中加标量为80.0 μg/kg、160.0 μg/kg、400.0 μg/kg，茶粉样品中加标量为40.0 μg/kg、80.0 μg/kg、200.0 μg/kg，饮料中加标量为8.0 μg/L、16.0 μg/L、40.0 μg/L，糖浆中加标量为40.0 μg/L、80.0 μg/L、200.0 μg/L，3个添加水平下各化合物的平均回收率及精密度如表9所示，化合物在4种不同基质中的平均回收率在68.2%～95.4%之间，RSD为1.6%～9.8%。

2.3.6 基质效应

基质效应（Matrix Effect，ME）存在于化学分析中，是指样品中干扰组分在分析物的分析过程中有显著的增强或者抑制效果，并影响分析结果的准确性。其计算公式为：ME(%) = B/A×100%。其中，A为待测物在纯溶剂中响应值，B为样品基质中添加相同含量分析物的响应值。用有机溶剂对样品直接进行提取时，片剂、饮料、糖浆、茶粉均存在不同程度的基体抑制效应，其中片剂的基质效应抑制程度可达50%以上，茶粉在40.5%～50.0%之间，饮料与糖浆在20.2%～32.0%。可通过对样品进行净化和稀释的方式来降低基体效应，本研究中通过优化前处理条件，各基体的抑制程度可降低至15.0%～40.6%，处于中等强度或弱强度抑制范围内（ME≤50%），能够满足检测要求。

2.4 U系列新型合成阿片类物质分析碎裂规律

在优化的质谱条件下对U系列新型合成阿片类物质的二级碎片特征离子进行分析及裂解规律探索。各化合物的二级碎片离子图如图2所示。以U-47700碎裂为例，如图3所示，当分子离子峰[M+H]⁺上环己基相连的取代基断裂，形成m/z为284.06的碎片离子1，该碎片离子响应较高；此外分子离子中苯酰胺结构与相连的环己基发生断裂，生成碎片离子2即环己基阳离子m/z 126.13，进而还能生成m/z为81.07的环己烯阳离子。如图4所示，当分子离子峰[M+H]⁺相连的整个环己基基团断裂时，将得到m/z为204.00的碎片离子3；当分子离子峰[M+H]⁺发生酰胺键断裂时，如图5所示，会生成碎片离子4，为酰阳离子m/z 172.96。由于U系列化合物的骨架相似，不同名称的化合物仅是苯环或环己基上取代差异，因此断裂规律类似，主要碎裂方式有环己基上的取代基断裂、连接环己基基团的碳氮键断裂以及酰胺键断裂。

通过对其他U系列化合物二级碎片离子的分析，当发生碎裂途径1时，分子离子峰环己基上的取代基发生断裂，因此U-49900产生m/z 284.06042、U-48800产生m/z 298.07596、MD-U-47700产生m/z 260.12805、N-Methyl U-47931E产生m/z 294.04868均可验证碎片离子1来源，除U-49900产生的m/z 154.19048，其余化合物分子离子峰产生的子离子m/z 126.13均为碎裂途径1中产生的碎片离子2即环己基阳离子，该碎片响应较低。当发生碎裂途径2时，分子离子峰上环己基与苯酰胺发生断裂，生成的碎片离子3分别为U-49900产生的m/z 203.99785、U-48800产生的m/z 218.01323、MD-U-47700产生的m/z 180.06560、N-Methyl U-47931E产生的m/z 213.98605。当发生碎裂途径3时，母核中酰胺键断裂，产生碎片离子4酰阳离子，根据U-49900产生的m/z 172.95572、U-48800产生的m/z 112.11234、MD-U-47700产生的m/z 149.02332、N-Methyl U-47931E产生的m/z 182.94417，可验证该途径的有效性。而化合物中m/z 81.07子离子均为结构中环己基与酰胺键断裂产生的环己烯阳离子，所有产生的二级碎片均满足以上3个途径的推测，因此验证了本文总结的U系列新型合成阿片类物质的质谱裂解规律。

2.5 实际样品的检测结果及分析

利用所建立的方法对不同基质类型的保健食品进行非定向筛查和定量分析，结果表明，目前在保健食品片剂、茶粉、糖浆、饮料中暂未发现U系列新型合成阿片类物质的情况，后续工作中将利用建立的方法开展持续性的保健品风险监测工作。

3 结论

本文采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法，结合Trace Finder 3.0筛查软件对保健食品中5种U系列新型合成阿片类物质进行非定向筛查分析，建立相关化合物数据库，能够对多种U系列新型合成阿片类物质同时进行定性确证，并通过优化前处理条件，对片剂、茶粉、糖浆、饮料4种基质中的待测物进行准确定量。本文通过二级碎片信息对U系列化合物的碎裂方式进行规律探索，推测出类似化合物的可能碎片离子，该筛查方法具有快速、简便、准确、灵敏的优点，可用于U系列新型合成阿片类物质的快速监测分析和定量检测，为口岸监控该类新精神活性物质提供技术手段。

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表2 5种U系列新型合成阿片类物质的分子式及相关质谱参数信息

Table 2 Molecular formula and related mass spectrometry parameter information of 5 U series novel synthetic opiates

注: ^*为定量分析时定量子离子

图1 不同提取溶剂中U系列新型合成阿片类物质的回收率

Fig.1 Recovery rates of U-series novel synthetic opioids in different extraction solvents

表4 不同净化剂用量提取片剂中U系列新型合成阿片类物质的回收率

Table 4 Recoveries of U series novel synthetic opioids in tablets with different dosage of purification agent in extraction solution

表5 不同净化剂用量提取茶粉中U系列新型合成阿片类物质的回收率

Table 5 Recoveries of U series novel synthetic opioids in tea powder with different dosage of purification agent in extraction solution

表6 不同净化剂用量提取饮料中U系列新型合成阿片类物质的回收率

Table 6 Recoveries of U series novel synthetic opioids in drink with different dosage of purification agent in extraction solution

表7 不同净化剂用量提取糖浆中U系列新型合成阿片类物质的回收率

Table 7 Recoveries of U series novel synthetic opioids in syrup with different dosage of purification agent in extraction solution

表9 3个添加水平下各化合物的平均回收率及精密度

Table 9 The average recoveries and precision of each compound at 3 spiked levels

图2 U系列化合物二级碎片离子质谱图

Fig.2 Secondary fragment ion mass spectrometry of U series compounds

图3 U-47700碎裂途径1

Fig.3 Fragmentation pathway 1 of U-47700

图4 U-47700碎裂途径2

Fig.4 Fragmentation pathway 2 of U-47700

图5 U-47700碎裂途径3

Fig.5 Fragmentation pathway 3 of U-47700

基金项目：伊犁师范大学污染物化学与环境治理重点实验室开放课题（NO.2021HJYB04）；四川省科技创新人才项目（2023JDRC0007）；新疆维吾尔自治区自然科学基金项目（2021D01A188、2020D01A126）

第一作者：李艳美（1985—），女，新疆伊宁人，硕士，高级工程师，主要从事食品农产品检测方法研究，E-mail: liyanmei1126@163.com

通信作者：王兴磊（1979—），男，新疆伊宁人，硕士，教授，主要从事污染物分析工作，E-mail: wangxl1127@sina.com.

1. 伊犁师范大学化学与环境科学学院，污染物化学与环境治理重点实验室 伊宁 835000

2. 伊宁海关技术中心 伊宁 835000

3. 成都海关技术中心 成都 610041

1. College of Chemistry ＆Environmental Sciences, YiLi Normal University, Key Laboratory of Pollutant Chemistry and Environmental Treatment, Yining 835000

2. Yining Customs Technology Center, Yining 835000

3. Chengdu Customs Technology Center, Chengdu 610041