白景莲 赵娜 顾晗潇 万超 陈溪 杨爱馥

Abstract In this study, we established a TaqMan real-time PCR method for rapid detection of Pisum sativum in foods. Specific primers and probes were designed according to conserved sequence of Lectin gene of Pisum sativum to test the target gene fragment in the samples. Species specificity analysis, sensitivity analysis, and actual application detection were conducted. The results showed that the established TaqMan real-time PCR detection method had strong specificity, and a specific amplification curve only appeared for Pisum sativum genomic DNA. The amplification results for the genomic DNA of the other 30 non-target control samples tested were all negative. The limit of detection was 0.1% (mass fraction) Pisum sativum powder per reaction. Using this method, 160 commercially available samples were tested. Samples containing Pisum sativum ingredients tested positive, consistent with the DNA barcode standard method detection results. Samples without Pisum sativum derived ingredients did not show an amplification curve, and the detection results were consistent with the product labels. The established TaqMan real-time PCR method has the characteristics of strong specificity, high sensitivity, rapidity and high sufficiency, and is suitable for rapid identification of Pisum sativum ingredients.

Keywords Pisum sativum; Lectin gene; TaqMan real-time PCR; authenticity identification

随着经济发展、民生水平的不断提高，人们对营养、健康的关注度日益增加，对食物多样化、优质化的需求明显提升，植物蛋白产品越来越受到市场青睐。植物蛋白不含胆固醇，并且几乎不含饱和脂肪酸^[1]，能有效降低心血管疾病、糖尿病和肿瘤风险^[2-5]，还具有低碳、可持续方面的环保优势^[6]。豌豆蛋白是植物肉和植物蛋白饮料的主要原料之一，含有成人所必需所有氨基酸，尤其是人体第一限制性氨基酸——赖氨酸含量高^[7]。此外，豌豆蛋白无致敏原，不含乳糖、谷蛋白和麸质，不含转基因成分，安全性更高^[8]，全球对豌豆蛋白的市场需求逐年增长^[9]。

技术创新推动了豌豆蛋白市场的强劲发展，除了植物肉制品和植物蛋白饮料，豌豆蛋白还被广泛用于运动营养、膳食补充类食品以及过敏原人群需求的替代性蛋白质食品。鉴于豌豆蛋白制品较高的营养价值和经济价值，其在国际贸易和市场流通领域易成为食品掺假目标。市场上销售的豌豆蛋白制品鱼龙混杂、真假难辨。目前食品成分真实性鉴定采用的方法主要包括：蛋白质组学和代谢组学检测法，即通过分析食物蛋白成分和代谢物的组成进行食品真实性鉴定^[10-11]；核酸检测法，即通过DNA序列分析或靶基因检测对食品物种来源进行鉴定^[12-13]。基于色谱/质谱技术的蛋白质组学和代谢组学检测依赖昂贵的大型仪器设备并需要构建全面准确的数据库，这两项技术的应用普及受到了极大的限制^[14-15]。核酸检测法主要包括PCR琼脂糖电泳法、实时荧光PCR法、DNA条形码技术和高通量基因测序技术等，这些方法也是目前公认的食品掺假鉴定的主流方法^[16]。其中，实时荧光PCR法因其具有特异性和精确性高、灵敏度强、速度快、重复性好、安全无污染、结果判断直观等优点，被广泛应用于食品掺杂鉴伪^[17-18]、过敏原检测^[19]、转基因成分检测^[20-21]、动植物源性成分检测^[22-23]、食源性致病菌检测^[24]等领域。

本研究采用TaqMan实时荧光PCR技术，建立了快速、灵敏、精准的豌豆成分真伪鉴别方法，旨在为完善食品安全标准体系、识别食品经济利益驱动型掺假行为、维护公平的市场环境以及保护消费者合法权益提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豌豆样品采购于大连市种子经销商。30种非目标源性对照样品，包括黄大豆、绿豆、芸豆、鹰嘴豆、扁豆、红豆、黑豆、花生、苜蓿9种近源双子叶豆科植物样品；芝麻、大米、黑米、红米、黄米、薏米、高粱米、玉米、大麦、小麦、燕麦、荞麦、黑麦、藜麦、奇亚籽 15种其他植物样品；以及香菇、木耳、牛肉、猪肉、鸭肉、鳕鱼 6种异源食用菌和动物样品。用于特异性检测的对照样品以及用于豌豆成分实际应用检测的市售食品购自大连农贸市场、超市和网络平台。

TAKARA Premix Ex Taq^TM Probe qPCR（货号RR390 A）；TIANGEN植物基因组 DNA 提取试剂盒（货号DP305）；合成引物、探针及测序由华大基因完成。

1.2 仪器与设备

WNB7 7 L恒温水浴锅购自Memmert公司；涡旋震荡仪购自 IKA公司；小型高速冷冻离心机购自 Eppendorf公司；NanoDrop Lite分光光度计购自ThermoFisher公司；电热恒温干燥箱UF450购自Memmert公司；研磨仪HM100购自北京格瑞德曼公司；QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR仪购自ABI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取

采用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒，按照操作说明进行DNA提取；用NanoDrop Lite分光光度计进行DNA纯度及浓度的测定。DNA模板的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之间，浓度为10～100 ng/μL适用于实时荧光PCR扩增。DNA模板置于-20℃冰箱备用。

1.2.2 特异性探针和引物设计

从GenBank数据库中下载豌豆Lectin基因序列（L11745.1），经过与黄大豆等近源物种序列比对，根据引物、探针差异性原则，利用软件Primer Premier5.0设计豌豆物种特异性引物和探针，并将引物探针与GenBank数据库进行BLAST比对，检测引物和探针的可行性。序列如下：Blec-F：5'-CTGGACGAGTCGCGTACTAGATC-3'； Blec-R：5'-TATAGGCACTT GGGTGTACTTT TAC-3'； Blec-P：FAM-5'-ATGCAATGCAGTCGGGTTTCGA CGACATCTT-3'-TAMRA。

1.2.3 实时荧光PCR反应体系和反应条件

实时荧光PCR反应体系为25 μL，包括：Premix Ex Taq^TM 12.5 μL，上游引物Blec-F（10 mmol/L）1.0 μL，下游引物Blec-R（10 mmol/L）1.0 μL，TaqMan探针Blec-P（10 mmol/L）0.5 μL，模板DNA（10～100 ng/μL） 2.0 μL，超纯水补足至25 μL。

实时荧光PCR反应程序：95℃预变性 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。荧光阈值为设备默认值。

1.2.4 实时荧光PCR方法特异性试验

提取1.1节中所述豌豆及其他30种非目标源性对照样品基因组DNA，按照1.2.3节方法进行实时荧光PCR扩增，测试引物和探针的特异性。

1.2.5 实时荧光PCR方法检出限试验

将豌豆、鳕鱼、黄大豆、扁豆和黑豆置于电热恒温干燥箱中烘干，用研磨仪打磨成干粉，分别以鳕鱼粉和易混豆粉（黄大豆、扁豆和黑豆比例为1∶1∶1）为基质，将豌豆和基质按照干重质量比1∶9进行混合，再用研磨仪充分打磨混合，制备豌豆/基质的质量分数为10%的掺入比例模拟样品。按照此方法制成豌豆/基质的质量分数分别为100%、10%、1%、0.1%、0.01% 5个不同掺入比例模拟样品，每组混合样品设9个平行重复。

取不同掺入比例模拟样品进行DNA提取，将DNA模板浓度调节至50 ng/μL，采用本文建立的TaqMan实时荧光PCR方法进行检测。根据≥95%置信水平法则^[25]，在9次平行试验中，9次结果均为检出的最低质量分数即为该方法的检出限。

1.2.6 市售样品检测

利用已建立的TaqMan实时荧光PCR方法对豌豆粒、豌豆粉、豌豆蛋白、植物肉、豆粉、豆奶等160份市售样品进行检测，同时对标签标明只含有单一豌豆成分的阳性样品采用DNA条形码标准方法^[26]进行ITS基因扩增并测序，将两种方法的检测结果进行对比，验证该方法在实际检测中的适用性和可行性。

1.3 数据处理

利用 Microsoft Excel 2016 对数据进行统计分析，数据以平均值±标准偏差（SD）表示。

2 结果与分析

2.1 豌豆成分TaqMan实时荧光PCR特异性检测

检测收集到的6份豌豆样品，以30种其他豆类等近源植物样品和异源食用菌和动物样品基因组DNA作为阴性对照，进行TaqMan实时荧光PCR法特异性试验。结果显示，应用本研究设计的特异性引物和探针，仅豌豆样品出现典型的扩增曲线，非目标源性对照样品和空白对照扩增结果均为阴性（图1），说明该方法具有很好的物种特异性。

2.2 豌豆成分TaqMan实时荧光PCR检出限试验结果

豌豆成分不同掺入比例模拟样品检测结果如图2所示，不同掺入比例豌豆成分含量与目标基因扩增的Ct值有很好的线性关系，豌豆成分含量越低，Ct值越高，豌豆成分含量在0.1% （质量分数）及以上均出现特征扩增曲线。同时，表1结果也显示，当掺入比为0.01%（质量分数）时，豌豆成分的检出次数仅为2/9；当掺入比≥0.1%（质量分数）时，豌豆成分9次平行试验的检出次数达到9次，满足≥95%置信区间的测试要求，且掺入比≥0.1% （质量分数）的4个梯度扩增Ct变异系数均＜2%，检测低限值目标基因的Ct变异系数为1.13，表明该方法重复性好，检出限可稳定达到0.1%（质量分数）。

非目标源性对照样品: 黄大豆、花生、芸豆、绿豆、鹰嘴豆、扁豆、红豆、黑豆、苜蓿、芝麻、大米、黑米、红米、黄米、薏米、高粱米、玉米、大麦、小麦、燕麦、荞麦、黑麦、藜麦、奇亚籽、香菇、木耳、牛肉、猪肉、鸭肉、鳕鱼; 空白对照: ddH₂O

图1 豌豆TaqMan实时荧光PCR特异性检测结果

Fig.1 Specific detection results of Pisum sativum by TaqMan real-time PCR

2.3 实际应用检测

对豌豆粒、豌豆粉、豌豆蛋白、植物肉、豆粉、豆奶等160份市售样品进行检测，其中含豌豆成分的样品检测结果均为阳性结果；同时对豌豆粒、豌豆粉，豌豆蛋白只含有单一豌豆成分的阳性样品采用DNA条形码标准方法^[26]进行ITS基因扩增并测序，结果为豌豆（P. sativum）源性，两种方法结果一致；不含豌豆源性成分的样品均未出现扩增曲线，检测结果为阴性（表2），检测结果与商品标识一致。可见本方法检测结果准确可靠，对食品中豌豆成分的检测具有很好的适用性。

3 结论

本研究以豌豆Lectin基因为检测靶标，设计特异性引物和探针，建立了豌豆成分TaqMan实时荧光PCR检测方法。本方法对黄大豆、黑豆、鹰嘴豆、芸豆、扁豆、绿豆、红豆、花生等近源豆科植物以及其它单子叶植物、食用菌、禽畜等非目标源性均无交叉反应，具有很好的物种特异性；对于豌豆成分的检出限可稳定达到其含量的0.1%（质量分数）。对160份市售商品进行实际应用检测，含豌豆成分样品实时荧光PCR检测结果与DNA条形码标准方法^[26]检测结果一致，不含豌豆成分的样品检测结果均为阴性，检测结果与商品标识一致，说明本方法检测结果准确可靠。同时，该方法适用于豌豆蛋白、豌豆泥、植物肉等深加工食品，在豌豆成分真实性鉴定中具有广泛的适用性和可行性。综上，本研究所建立的豌豆成分实时荧光PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、稳定性好的优势，且操作简单、快速、检测成本较低，满足了食品成分真实性鉴别迅速准确的需求，可作为国际贸易和市场流通中豌豆蛋白制品真实性鉴别的有效检测手段，为打击掺假欺诈、规范市场秩序和确保食品质量安全提供技术支撑。

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A. 模拟添加鳕鱼粉检测结果; B. 模拟添加易混豆粉检测结果

图2 豌豆成分不同掺入比例模拟样品检测结果

Fig.2 Test results of simulated samples with different mixing ratios of Pisum sativum ingredients

表1 豌豆成分TaqMan实时荧光PCR方法检出限结果

Table 1 Detection limit results of TaqMan real-time PCR method for Pisum sativum ingredients

表2 实际应用检测结果

Table 2 Detection results of actual application