罗吉 李冰 赵少浩 于志强 刘汉伟 黄昕

染发剂是一类被广泛使用的特殊用途化妆品，主要由染料、稳定剂、氧化剂等物质组成^[1]。随着人民生活水平的提高和人口老龄化的加剧，染发剂的市场需求将日趋渐增。氧化型染发剂颜色种类繁多，着色稳固且染色效果明显，深受消费者青睐。但是氧化型染发剂中含有的苯胺类物质经氧化后，容易在使用中引发不同程度的致敏和皮肤损害。从氧化型染发剂的配方组分^[2]并结合大量的资料研究表明，氧化型染发剂具有明显的细胞毒性作用^[3]。此外，氧化型染发剂中的氧化剂过氧化氢及主要染料对苯二胺等氧化产物具有一定的遗传毒性^[4]。氧化染料是合成染料中最早用于毛发染色的，也是目前应用最广泛的持久性染发剂原料，在氧化剂作用下，苯胺类物质被氧化成为染料中间体，该中间体又在偶合剂的作用下发生偶合反应，产生颜色从而发挥染发作用。目前使用较多的氧化染料为苯二胺、对苯二胺、间苯二酚等。

东亚人群发色以黑色为主，所以黑色染发剂在我国中老年人群中使用率较高，而黑色染发剂的应用与许多重大疾病的发病风险增加密切相关，例如膀胱癌、乳腺癌、非何杰金氏淋巴瘤、皮肤基底细胞癌、白血病等^[5]。因此为保护消费者的健康，应当全面而客观地评价染发剂的毒性，并对目前我国市售染发剂的卫生安全状况进行深入研究。本文抽取一款染发剂进行了包括体内试验和体外试验的三项致突变试验，反映其染色体畸变、基因突变等遗传学终点，对氧化型染发剂的遗传毒性进行多方面的试验和研究。

1 材料与方法

1.1 受试物

某品牌市售染发剂由A剂和B剂组成，A剂为浅黄色膏体，B剂为白色乳液，试验前按使用要求1:1等量均匀混合后配制成各浓度供试。

1.2 实验材料

Ames标准实验菌株TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535由MOLTOX提供，产品质量保证证书批号分别为5489D、5492D、5506D、5499D、5504D。

SPF级ICR小鼠由上海杰思捷实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0004，实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2021-0032，体重25～30 g，共50只，雌雄各半。

中国仓鼠肺细胞株（CHL）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.3 实验方法^[6]

1.3.1 Ames试验

采用平板掺入法，分别在加与不加S₉条件下进行试验。染发剂剂量组设为12.5 μL/皿、25.0 μL/皿、50.0 μL/皿、100.0 μL/皿，同时设空白对照、溶剂对照、阳性诱变剂对照和无菌对照组。每组设3皿平行，在37℃恒温条件下培养48 h后，计数各组每皿回变菌落数，如果受试物TA1535回变菌落数是溶剂对照的回变菌落数的3倍或3倍以上，受试物TA97a、TA98、TA100、TA102的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的2倍或2倍以上，则该受试物判定为致突变阳性。

1.3.2 体内哺乳动物细胞微核试验

采用25～30 g ICR小鼠，设受试物组、阴性对照组和阳性对照组，每组10只，雌、雄性各半。染毒剂量分别为1250 mg/kg·BW、2500 mg/kg·BW、5000 mg/kg·BW，阴性对照为灭菌蒸馏水，阳性对照为环磷酰胺40 mg/kg·BW，均按0.2 mL/g体重灌胃。采用30 h给受试物法，两次给受试物间隔24 h，第2次给受试物后6 h，颈椎脱臼处死小鼠，去股骨以小牛血清冲洗骨髓腔，制成细胞悬液涂片，自然干燥，放入甲醇固定5 min，放入Giemsa应用液中染色，镜检。每只动物计数2000个PCE中含有的微核数。微核细胞率（MN‰）指含有微核的PCE数，以千分率表示。1个PCE中出现有2个或多个微核，仍按1个计数。此外，每只动物观察200个红细胞，计数PCE与RBC（总红细胞）的比例。采用泊松分布u检验对各组间的微核率进行比较。剂量组在统计学上有显著性差异，并有剂量反应关系，则可认为微核试验阳性。

1.3.3 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

根据受试物的毒性和溶解度的最高剂量设计原则，不加S₉剂量为1000 μg/mL、2000 μg/mL和4000 μg/mL；加S₉剂量为1250 μg/mL、2500 μg/mL和5000 μg/mL，同时分别设阴性对照组和阳性对照组。将5 mL浓度为1×10⁵个/mL的细胞悬液接种于25 cm²培养瓶中，置于37℃的CO₂培养箱中培养24 h，倾去培养液，每个培养瓶内加入4.0 mL培养液，0.5 mL受试物和0.5 mL S₉混合液（不加S₉时，加入0.5 mL培养液补足），置于CO₂培养箱内作用3 h。弃培养液，用Hanks液洗细胞3次。加入5 mL含10%胎牛血清的培养液，再置于CO₂培养箱中培养，于24 h内收获细胞。收获细胞前4 h，加入终浓度为1 μg/mL的秋水仙素溶液。低渗，制片并经姬姆萨染液染色，每组各选100个分散良好的中期分裂相细胞，进行染色体畸变分析，观察记录染色体畸变类型和畸变数目，计算细胞畸变率。受试物组的畸变细胞率增加较阴性对照组差异有统计学意义，并有剂量反应关系或者某一剂量组有显著性意义的增加，并有可重复性，判为阳性。

2 实验结果

2.1 Ames试验

根据受试物的毒性和溶解度的最高剂量设计原则，预试验结果为在加和不加S₉的情况下样品原液未见杀菌作用，且易溶于水。在本试验条件下，经5株标准菌株测定后，在加S₉的情况下，菌株TA98在12.5 μL/皿、25.0 μL/皿、50.0 μL/皿、100.0 μL/皿剂量组中的回变菌落数是溶剂对照组回变菌落数的2倍以上，复测结果显示有可重复性。综上所述该样品为致突变阳性，具体检测结果见表1。

2.2 体内哺乳动物细胞微核试验

与阴性对照组比较，阳性对照组小鼠骨髓中含微核的嗜多染细胞数显著升高（P＜0.05），各受试物组的嗜多染红细胞微核率与阴性对照组进行比较，显示差异无统计学意义（P＞0.05），具体实验数据见表2。

2.3 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

对受试物溶解情况（表3）、细胞毒性（表4）、各处理组和对照组染色体畸变率及统计结果（表5）进行分析。在本试验条件下，阳性对照组细胞畸变率显著高于阴性对照组，且受试样品任一剂量组与阴性对照组差异均不显著，受试物不引起培养的哺乳动物体细胞染色体结构畸变。因此，在本试验条件下，无论是否含有S₉，该受试样品体外哺乳动物染色体畸变试验结果为阴性，未见致突变性。

3 结论

本研究的Ames试验的4个剂量组为12.5 μL/皿、25.0 μL/皿、50.0 μL/皿、100.0 μL/皿，在加S₉的情况下，菌株TA98在12.5 μL/皿、25.0 μL/皿、50.0 μL/皿、100.0 μL/皿剂量组中的回变菌落数是溶剂对照组回变菌落数的2倍以上，并经复测，结果有可重复性，表明该染发剂对机体产生的危害可能需经体内代谢酶系统的活化后才出现其致突变作用。进一步开展体内哺乳动物细胞微核试验及体外哺乳动物细胞染色体畸变试验后发现，该染发剂未引起小鼠骨髓嗜多染红细胞含微核细胞率的增加，对体外哺乳动物细胞染色体畸变率无影响，未见致突变性。在对该染发剂的致突变研究中，仅在具有体外代谢活化条件下才对TA98菌株出现致突变作用。相关研究表明，氧化型染发剂染料经过氧化氢氧化后，其氧化产物再经代谢活化后对TA98具有较强的回复致突变作用^[7-8]，本试验结果与该研究结论一致，为市场上同类染发剂产品的安全性研究提供参考^[9]。

参考文献

[1] 吴燕. 染发剂的分类及其分析方法[J]. 职业与健康, 2017, 33(16): 2287-2290.

[2] 万方, 汪俊峰, 陈敏东. 染发剂染料组分的检测分析方法综述[J]. 天津化工, 2017, 31(2): 5-7.

[3] 陈秀娟, 李培宁, 江漪, 等. Ames试验与HPRT试验两种方法对6种氧化型染发剂的检测[J]. 癌变·畸变·突变, 2023, 35(1): 58-62.

[4] 杜文亚, 云冠群, 许智博, 等. 染发类化妆品中对苯二胺等32种染发剂的检测结果分析[J]. 中国食品药品监管，2022(4): 74-81.

[5] 何冬梅, 王建, 严级文, 等. Ames试验对特殊用途化妆品致突变性的研究[J]. 中国卫生检验杂志，2007, 17(11): 1956-1958.

[6] 国家食品药品监督管理总局化妆品标准专家委员会. 化妆品安全技术规范（2015年版）[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2018: 503-512,519-521.

[7] BAIDOUN F, ELSHIWY K, ELKERAIE Y, et al. Colorectal cancer epidemiology: recent trends and impact on outcomes[J]. Curr Drug Targets, 2021, 22(9): 998-1009.

[8] 江漪, 吴剑辉, 朱素珍, 等. 178件染发类化妆品细菌回复突变试验结果分析[J]. 癌变·畸变·突变, 2022, 34(5): 384-387.

[9] 秦美蓉, 王晓炜, 王平. 化妆品遗传毒性试验研究进展及思考[J]. 日用化学工业，2018, 48(10): 595-600.

基金项目：海关总署科研项目（2021HK227）

第一作者：罗吉（1993—），女，汉族，浙江宁波人，本科，工程师，主要从事毒理学安全性评价工作，E-mail: 13065664145@163.com

通信作者：刘汉伟（1980—），男，汉族，山东栖霞人，博士，高级工程师，主要从事毒理学安全性评价工作，E-mail: 13646621936@163.com

1. 宁波海关 宁波 315000

2. 宁波中盛产品检测有限公司 宁波 315000

1. Ningbo Customs District, Ningbo 315000

2. Ningbo Joysun Product Testing Co., Ltd., Ningbo 315000

表1 Ames试验菌株回变菌落数

Table 1 The number of revertant colonies in the Ames test

注: *指与溶剂对照组平均回变菌落数比较≥2倍, “—”代表数据不存在

表1（续）

表2 微核试验微核率统计结果

Table 2 Statistical results of micronucleus rates in the micronucleus test

注: *代表与阴性对照组比较, P＜0.05; 微核率(‰)和PCE/NCE以小鼠为单位统计, 表示为均值±标准差

表3 受试物在所选溶剂中的溶解情况

Table 3 Dissolution of the test substance in selected solvents

表4 受试物对细胞的毒性

Table 4 Toxicity of the test substance to cells

表5 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验结果

Table 5 In vitro mammalian cell chromosome aberration test results

注: *代表用χ²检验进行统计学分析, 与阴性对照组比较, P＜0.05

基金项目：海关总署科研项目（2021HK181）；国家重点研发计划项目（2021YFC2300904）

第一作者：高志强（1974—），男，汉族，内蒙古乌兰察布人，博士，研究员，主要从事动物医学相关工作，E-mail: gaozhiqiang02@163.com

通信作者：汪琳（1974—），女，汉族，湖北随州人，博士，研究员，主要从事动物医学相关工作，E-mail: 15301090661@139.com

1. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

2. 长沙海关 长沙 410000

1. China Customs Science and Technology Research Center, Beijing 100026

2. Changsha Customs, Changsha 410000