张烈远 余萍 张书敏 韩颖 熊超 江龙发

Abstract In this study a high performance liquid chromatography analytical method for the determination of biuret content in export potassium humate was established. Potassium humate was purified by flocculation precipitation of zinc sulfate and potassium hydroxide. HPLC Column C18 (4.6 mm×250 mm, 5.0 μm) was used as mobile phase with potassium dihydrogen phosphate solution+methanol (95+5). The measurement wavelength was 200 nm, and the external standard method was used for quantification. The experimental results showed that when the sample weight was 0.5 g, the limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) was 0.003% and 0.01%, respectively. The linear correlation coefficients were more than 0.999 in the range of 0.01 to 0.2 mg/mL. The average recoveries of the three mass concentration levels were in the range of 100.0% to 104.0%, with the relative standard deviation (RSD) in the range of 1.8% to 2.0% (n = 6). The method is accurate and simple, and can be used for the determination of biuret in export potassium humate. It fills the blank of the detection of biuret in non-inorganic fertilizers, and provides technical support for Customs law enforcement.

Keywords high performance liquid chromatography; potassium humate; biuret

肥料是能够提供、保持或改善作物营养和土壤性能，提高农产品产量，改善农产品品质，增强作物抗逆性的有机、无机、微生物及其混合物料，在现代农业生产中，肥料在提高生产效率和粮食增产中发挥着重要作用^[1-2]。肥料质量关系到粮食安全和环境保护，国家强制性标准《肥料中有毒有害物质的限量要求》（GB 38400—2019）明确指出，缩二脲的含量必须≤1.5%。缩二脲的含量过高会影响种子发芽，导致植物根茎腐烂，作物枯死^[3-4]。目前我国已有缩二脲国标方法：《复混肥料(复合肥料)中缩二脲含量的测定》（GB/T 22924—2008）^[5]、《肥料和土壤调理剂 尿素基肥料中缩二脲含量的测定 高效液相色谱法》（GB/T 42307—2023）^[6]，但都是针对无机肥料，对于非无机肥料标准方法适用范围不合适。根据海关总署公告2021年第81号（关于调整必须实施检验的进出口商品目录的公告）要求：对涉及出口化肥的29个10位海关商品编号全部列入法定检验检疫出口商品名录，海关需对相关出口商品实施商品检验^[7]。目前海关监管过程中遇到的非无机肥料中出口腐植酸钾的缩二脲检测现有标准并不适用，为满足海关执法的需求，开发出准确、简便，可用于出口腐植酸钾中缩二脲含量测定的检测方法具有重要意义。

1 实验部分

1.1 主要试剂及仪器

甲醇（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；磷酸二氢钾（分析纯，西陇科学股份有限公司）；七水合硫酸锌（分析纯，西陇化工股份有限公司）；氢氧化钾（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；缩二脲（w = 98.5%）（标准品，坛墨质检标准物质中心）；0.45 μm滤膜、0.22 μm亲水聚四氟乙烯滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司）；密理博超纯水。

1260高效液相色谱仪，配备四元梯度泵，二极管阵列检测器（美国安捷伦科技有限公司）；S220 pH计、ME204E电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；TD4N离心机（长沙英泰仪器有限公司）；1 mL移液枪（德国Eppendorf有限公司）；VORTEX-GENIE2 漩涡混合器（美国Scientific Industries有限公司）。

腐植酸钾，产地为萍乡，粉碎后过0.5 mm孔径筛网，四分法缩分至100 g，密封保存于阴凉干燥处。

1.2 色谱条件

色谱柱：OmniGeneLLC Hubble C₁₈（4.6 mm× 250 mm，5.0 μm）；进样量：5 μL；流动相：磷酸二氢钾溶液+甲醇（95 + 5）；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；检测波长：200 nm；等度洗脱。

1.3 溶液配制

1.3.1 试剂配制

硫酸锌溶液500 g/L：称取50 g硫酸锌，用水溶解后定容至100 mL，摇匀于棕色瓶中保存；氢氧化钾溶液500 g/L：称取50 g氢氧化钾，用水溶解后定容至100 mL，摇匀于聚乙烯瓶中保存；磷酸二氢钾溶液10 g/L：称取10 g磷酸二氢钾溶解入1 L水中，用氢氧化钾溶液调至pH = 6.0，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，备用。

1.3.2 标准品溶液的制备

称取缩二脲标准品约5 mg（精确至0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，加少量纯水溶解后定容至刻度，摇匀，配制成约为0.5 mg/mL的标准溶液。分别准确量取标准溶液适量，加流动相分别稀释成0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL系列标准曲线溶液。

1.4 样品前处理方法

准确称取腐植酸钾约0.5 g（精确至0.0001 g）至50 mL离心管中，加25 mL流动相溶解，加入硫酸锌溶液6 mL，摇匀后，加入氢氧化钾溶液2 mL，有大量絮状沉淀生成，加流动相定容至刻度，摇匀，静置5 min，以5000 r/min离心5 min后，样品试液出现明显分层。取离心管上清液适量，用0.22 μm亲水聚四氟乙烯滤膜过滤，得上机待测溶液。同时进行空白试验。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

设置190～400 nm的波长全扫描，目标物的吸收曲线在196～200 nm有强吸收，目标物出峰前和出峰后196～200 nm也有强吸收，原因是采用等度洗脱的流动相里含有5%的甲醇，甲醇在196～200 nm有强吸收，但是目标物缩二脲的吸收值远远高于背景值，故选择检测波长为200 nm。190～400 nm吸收光谱曲线图如图1所示。

图1 190～400 nm吸收光谱曲线图

Fig.1 Absorption spectrum curve in the range of 190 nm to 400 nm

2.2 定容溶液的选择

定容溶液的选择应充分考虑溶剂效应对目标物色谱峰的影响，溶样溶剂与流动相比例存在差异时会导致色谱保留行为异常，通常表现为目标物保留时间偏移，色谱峰展宽、前沿、分叉、裂分现象^[8]。为了合理选择定容溶液，分别使用纯水和流动相对腐植酸钾进行溶解，最终定容至50 mL。实验结果表明，定容溶液为流动相的样品干扰比定容溶液为纯水的干扰更少。定容溶液为纯水时目标峰的保留时间更小，并出现强度较高的裂分倒峰，对目标峰的定量干扰较大，定容溶液为流动相保留时间更长，避免了液相进样系统死时间峰的干扰。两种定容溶液高效液相色谱图如图2所示。

图2 定容溶液分别为纯水（A）和流动相（B）高效液相

色谱图

Fig.2 HPLC of pure water (A) and mobile phase (B)

2.3 净化剂加入量的选择

腐植酸钾溶于水后呈现黑色溶液，加入硫酸锌能够和腐植酸钾发生反应生成腐植酸锌，腐植酸锌和氢氧化钾反应生成氢氧化锌絮状沉淀净化腐植酸钾^[9]。为了保证良好的净化处理效果，按照样品前处理方法进行实验，净化剂硫酸锌和氢氧化钾采用控制单一变量的方法进行实验。实验结果表明，当溶液呈中性时，样品净化完全；1号样品空白呈黑色溶液，无沉淀，样品溶液pH呈碱性，随着净化剂的加入黑色溶液颜色逐渐褪去，沉淀逐渐增多，到4号样品变成澄清透明溶液，4～7号沉淀不再增加。为了避免硫酸锌溶液的过量使用，对液相系统造成不必要的损害，最终选择4号样品为最佳处理方式。实验方案和实验效果见表1。

2.4 标准曲线、检出限、定量限

本研究按照上述色谱条件和样品前处理方法处理，并配制系列标准工作溶液进行上机测定，外标法定量。以缩二脲上机浓度测算，方法检出限（信噪比S/N = 3）为0.003%，定量限（信噪比S/N = 10）为0.01%。缩二脲的标准曲线参数、检出限、定量限见表2。

2.5 回收率、精密度

阴性样品在0.01 mg/mL、0.08 mg/mL、0.16 mg/mL 3个上机浓度水平进行添加回收实验，每个上机浓度水平均制备6份平行样，按上述色谱条件和前处理方法检测，阴性样品中缩二脲的添加回收率及相对标准偏差见表3。上述实验数据表明：平均回收率为100.0%～104.0%，相对标准偏差1.8%～2.0%，该方法测定结果准确，能够用于出口腐植酸钾中缩二脲的定量分析。

2.6 实际样品检测

采用建立的方法对21批出口腐植酸钾进行检测，缩二脲含量均小于0.01%，质控样品的回收率和精密度符合上述条件。

3 结论

当称样量为0.5 g时，选定检测波长为200 nm，以6 mL硫酸锌溶液和2 mL氢氧化钾溶液生成絮凝沉淀方式净化腐植酸钾，最终以磷酸二氢钾溶液+甲醇（95 + 5）为定容溶液。方法检出限、定量限、添加回收率和精密度均符合《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017）有关要求^[10]。该方法准确、简便，可用于出口腐植酸钾中缩二脲的测定，填补了非无机肥料中缩二脲含量的检测方法的空白，为海关执法提供了技术支撑。

参考文献

[1] 肥料标识 内容和要求: GB 18382—2021 [S]. 北京: 中国标准出版社, 2021.

[2]张生来. 土壤肥料在农业持续发展中的作用研究[J]. 河南农业, 2019, 493(5): 60-61.

[3]肥料中有毒有害物质的限量要求: GB 38400—2019 [S]. 北京: 中国标准出版社, 2019.

[4]李西桐, 张丽萍, 鲁莲香.化肥中缩二脲对农作物的危害及防治[J]. 云南农业, 2020, 374(3): 79.

[5]海关总署公告2021年第81号(关于调整必须实施检验的进出口商品目录的公告)[EB/OL]. http://nanjing.customs.gov.cn/customs/302249/302266/302267/3957218/index.html/2021-10-11/2023-7-1.

[6]复混肥料(复合肥料)中缩二脲含量的测定: GB/T 22924—2008 [S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[7]肥料和土壤调理剂 尿素基肥料中缩二脲含量的测定 高效液相色谱法: GB/T 42307—2023 [S]. 北京: 中国标准出版社, 2023.

[8]安琪, 孙红, 武林芝, 等. 高效液相色谱中溶剂效应的探讨及消除方法[J]. 广州化工, 2022, 50(8): 95-98.

[9]付智慧. 絮凝沉淀预处理测定含黄腐酸尿素中缩二脲的方法研究[J]. 化肥设计, 2022, 60(1): 21-24.

[10]合格评定 化学分析方法确认和验证指南: GB/T 27417—2017 [S]. 北京: 中国标准出版社, 2017.

表1 实验方案和实验效果

Table 1 Experimental scheme and experimental effect

表2 缩二脲的标准曲线参数、检出限、定量限

Table 2 Standard curve parameters, limit of detection and limit of quantitation of biuret

表3 阴性样品中缩二脲的添加回收率及相对标准偏差（n = 6）

Table 3 Recoveries and relative standard deviation of biuret addition in negative samples (n = 6)

科研项目：海关总署科研项目（2022HK112）

第一作者：李月（1984—），女，汉族，辽宁鞍山人，硕士，高级工程师，主要从事网络信息安全、数据治理、信息技术应用及管理等工作，E-mail: 198503116@qq.com

通信作者：张君（1985—），男，汉族，江苏金湖人，本科，工程师，主要从事海关信息化系统建设和研究，E-mail: zj20032801@163.com

1. 中国电子口岸数据中心上海分中心 上海 200120

2. 交通银行 上海 200080

3. 上海海关 上海 200433

1. China E-Port Data Center Shanghai Branch, Shanghai 200120

2. Bank of Communications, Shanghai 200080

3. Shanghai Customs, Shanghai 200433