赵优 李家侨 张娜

Abstract In this paper, fluorescent amplified fragment length polymorphism (fAFLP) labeling technology was used to amplify and analyze the genetic structure of 269 samples from 10 populations of Jingdong chestnuts a specialized nut export from Yanshan area. The results showed that there were 383 amplified loci in the range of 70-500 bp, among which 314 were polymorphic, accounting for 81.89% of the total. The average values of observed allele number, effective allele number, Nei diversity indexand Shannon information index in 10 populations were 1.4573±0.0905, 1.3101±0.0611, 0.1702±0.0297 and 0.2514±0.0487, respectively. The genetic distance of the 10 populations ranged from 0.0454 to 0.1563, and the similarity coefficient ranged from 0.8234 to 0.9786. The dendrogram of Jingdong chestnuts was obtained by UPGMA clustering. The study of the genetic structure of the main export Jingdong chestnut populations in China aims to provide basic data for the rational assessment and protection of genetic resources, genetic breeding, and quality improvement, and maintain the international market reputation of chestnuts.

Keywords Jingdong chestnuts; fAFLP; genetic diversity; hierarchical cluster analysis (HCA)

板栗（Castanea mollissima Blume）又名栗，为壳斗科（Fagaceae）栗属（Castanea Miller）植物。由于其营养丰富，具有抗菌消炎、抗凝血、提升细胞活性的功能，素有“东方珍珠”的美誉。板栗原产于我国，是重要的经济林树种。燕山板栗种植于东起山海关，西至北京西郊约400 km的山坡沟谷，因此燕山产板栗也被称为京东板栗。京东板栗果型端正，色泽艳丽，涩皮易剥，具有香、甜、糯等特点，被誉为板栗中的佳品，远销东南亚、北美、欧洲、日本及韩国市场。随着板栗加工技术水平提升，加快了产业化发展进程，成为我国出口创汇最高的特产果品之一。

群体的遗传多样性越丰富，表明群体遗传结构越稳固，物种适应环境变迁的能力就越强。研究生物的遗传多样性，有助于揭示群体的遗传结构，对物种的种质鉴定、系统发生及良种选育具有重要意义。燕山是我国板栗的古老产区，蕴藏着丰富的板栗变异类型，是我国板栗遗传研究和创新改良的优质材料来源^[1]。随着板栗生产标准化的推广，实现了京东板栗生产品种化、规模化和产业化发展，产量和品质得到大幅度的提高和改善，京东板栗（河北省）和燕山板栗（北京市）获得地理标志产品保护。但受利益驱动，一些不法栗商用价格低廉的板栗冒充京东板栗出口，致使京东板栗的品牌信誉受到一定损害。

扩增片段长度多态性技术（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是1993年发展起来的一种检测DNA多态性的方法，具有实验结果稳定、信息量大等优点，在动植物品种鉴定及遗传多样性研究中得到广泛应用^[2]。荧光标记扩增片段长度多态性技术（fluorescent AFLP，fAFLP ）是以AFLP技术为基础，利用JOE、ROX、FAM等荧光素标记的选择性引物进行PCR扩增，并通过DNA 测序仪自动采集图像和数据，使得检测更加精准、快捷^[3]。国内外目前已利用随机扩增多态性DNA（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）^[4-5]、内部简单重复序列（inter-simple sequence repeat ，ISSR）^[6]、简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）^[7-9]及AFLP ^[10]等分子标记技术对板栗种质资源遗传多样性进行相关研究，但目前对出口京东板栗主要品种遗传结构研究相对较少。为了更好地了解出口京东板栗种质资源现状，开发优质板栗品种，本研究利用fAFLP 荧光标记法对京东板栗主要出口品种进行遗传多样性分析，以期为研究出口京东板栗品种指纹图谱构建、资源评估与保护及板栗遗传育种开发提供技术参考，以更好推动优质农产品出口创汇。

1 试验材料

2020年8月至2022年10月，采集燕山山脉京东板栗主要品种样本9份，包括北峪2号（河北遵化）、燕山红（河北宽城）、燕山魁栗（河北迁西）、早熟3113（河北遵化）、大板红（河北迁西）、怀九（河北青龙）、燕山短枝（河北迁西）、燕明（河北抚宁）、燕山早丰1号（河北迁西），以及泰山油栗（山东泰安）1份，样本数共计269个。所有样品经数码相机拍照和形态学测量鉴定，低温保存用于DNA提取。

2 试验方法

2.1 DNA提取

本试验采用天根（多糖多酚）试剂盒进行板栗DNA提取。将板栗经形态学鉴定后，去壳研磨成粉，参照试剂盒说明书操作。提取后的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测后置于-80℃冰箱备用。

2.2 AFLP分析

2.2.1 双酶切和接头连接

参照Vos等^[2]技术方法，首先取100 ng基因组DNA，用EcoRⅠ和MseⅠ进行双酶切，37℃酶切1 h。反应体系包括酶切产物4 μL，10×T4 DNA buffer 2.5 μL， EcoR I /Mse I各2 μL，T4 Ligase（3 U/μL）1 μL，10 mM ATP 2.5 μL，加ddH₂O至20 μL，37℃保温5 h，8℃保温4 h，4℃过夜。

2.2.2 预扩增反应

采用25 μL反应体系：Mse I和EcoR I引物1 μL，dNTPs 2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq酶 0.5 μL，模板DNA 2 μL加ddH₂O至25 μL，离心数秒。按下列参数进行PCR 扩增：94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30个循环；最后72℃ 5 min。扩增产物1︰20倍稀释用于下一步选择性扩增。

2.2.3 选择性扩增反应

通过对8对引物64个组合的筛选，筛选重复性好、多态性较高的4对选择性引物组合（表1），扩增体系包括：10× PCR Mix 2 μL，引物各1 μL，预扩产物稀释后DNA 5 μL，dNTPs 1 μL，Taq酶0.5 μL，最后加ddH₂O至20 μL。PCR扩增程序为：95℃ 变性1 min，65℃ 复性30 s（每循环降低0.7℃），72℃ 延伸1 min， 12个循环； 94℃ 变性30 s，56℃ 复性30 s，72℃ 延伸60 s， 23个循环。选择性扩增产物加入内标，运用荧光标记和毛细管电泳分离技术，经全自动测序仪分析，采集数据完成检测，检测结果通过Genescan软件进行分析并转换成“0、1”矩阵，供后续数据处理和分析。

2.2.4 数据分析

利用Quantityone对扩增图谱进行逐一分析比较，有谱带记为1，无谱带记为0，获得1和0构成的数字矩阵。利用POPGENE32软件统计多态位点数（Number of polymorphic loic，NP）、多态位点比例（Percentage of polymorphic loic，P）、观测等位基因数（Observed number of alleles，Na）、有效等位基因数（Effective number of alleles，Ne）、Nei’s遗传多样性指数（Nei’s gene diversity，H）、Shannon’s指数（Shannon information index，I）等；利用 NTSYS 2.10 软件计算10个板栗群体遗传相似系数（Genetic similarity coefficient，N）和遗传距离（Genetic distance，D），采用MEGA 6.0软件构建UPGMA聚类树。

3 结果分析

3.1 AFLP扩增结果

利用4个fAFLP选择性引物组合，在10个板栗群体共扩增出个位点383个，位点大小在70～500 bp范围内，每对引物扩增位点83～104个，平均每对引物扩增位点95.50个；多态性位点314个，每对引物扩增多态性位点62～87个，多态性位点百分率在74.70%～85.86%之间，平均多态位点比例81.89%（表2）。图1为P2引物组合扩增结果。

3.2 群体遗传多样性及遗传分化分析

本研究对10个京东板栗品种种群遗传多样性参数进行分析（表3），结果显示，10个群体内多态位点百分率在33.25%～61.26%之间，Nei’s基因多样性指数H值在0.1341～0.2138 之间，Shannon’s信息指数I值在0.1953～0.3399之间，AP、P、Na、Ne、H、I揭示的规律大致一致，我国10个京东板栗种群遗传多样性从高到低依次为：泰山油栗＞燕山红＞早熟（3113）＞北峪2号＞燕明＞燕山短枝＞燕山魁栗＞怀九＞大板红＞早丰1号。

3.3 群体间遗传距离及聚类分析

10个群体间Nei’s 遗传距离D值（Nei，1978）的变化范围在0.0454～0.1563之间，相似系数N值的变化范围在0.8553～0.9556之间。其中，燕山红、早熟（3113）群体遗传距离最小，相似系数最高；燕山魁栗、泰山油栗群体遗传距离最大，相似系数最低，见表4。10个品种构建UPGMA群体聚类情况如图2所示。

图2 10个京东板栗群体UPGMA聚类图

Fig.2 UPGMA dendrogram for 10 populations of Jingdong chestnuts

由图2可知，我国燕山山脉10个板栗种群中燕山红、早熟（3113）、北峪2号距离最近，聚为一支，其次燕山短枝和燕明聚为一支，此外，怀九、早丰1号、燕山魁栗、大板红依次与以上两个支系聚为一支，泰山油栗与其他群体距离最远，单独聚为一支。

4 讨论

本研究利用fAFLP荧光标记分析燕山山脉地区以出口为主的京东板栗品种群体遗传结构，扩增多态位点比例为81.89%，高于王同坤等^[11]报道的利用AFLP传统银染法扩增出多态位点比例56.5%的结果，表明fAFLP荧光标记技术扩增结果更加精准、更具可比性，可在出口农产品种质资源指纹图谱构建、资源评估与保护等方面广泛应用。

生物群体的遗传多样性是评价生物资源状况的一个重要依据，一般而言，遗传多样性愈丰富，对环境变化适应性和生存潜力就愈大。本研究显示京东板栗主要出口品种遗多样性H值在0.1341～0.2138 之间，I值在0.1953～0.3399之间，略高于艾呈祥等^[10]报道的秦巴山区野生板栗群体多样性结果，说明京东板栗主要出口品种有相对稳定遗传结构，为其资源的保护及利用提供较好的遗传基础。本研究中10个板栗种群遗传多样性高低，可为板栗遗传育种及资源管理与开发提供参考。Thorp^[12]通过分析研究认为：同科属群体间I在0.5～0.9之间（D为0.1～0.5）；同种群体间I 在0.8～0.97之间（D为0.03～0.2）。本研究计算得出 10个群体间Nei’s 遗传距离D值在0.0454～0.1563之间，相似系数N值在0.8553～0.9556之间，此结果与Thorp报道的同种群间I、D值变化范围基本一致。

京东板栗作为我国优质出口农产品资源，加强其种质资源保护及研究对提升我国出口板栗溯源管理具有重要意义。随着高通量测序技术的快速发展，单核酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）、表达序列标签（Expression sequence tag，EST）及插入缺失标记（Insertion-deletion，InDel）等分子标记技术越来越多地应用于动物、植物物种鉴定、遗传结构及基因组选育等方面的研究，例如聂兴华等^[13]利用高通量测序技术明确了野生板栗的分类地位，得出野生板栗与栽培板栗属于同一种的结论；Clément Larue等^[14]开发了板栗68个SNP标记用于品种遗传结构分析；刘伟等^[15]对中国板栗EST-SNP和抗栗疫病候选基因分析及同源比对，开发出3023个EST-SNP标记用于抗栗疫病居群基因组学研究。鉴于单一分子标记技术在群体遗传结构分析方面的局限性，有必要结合其他分子标记技术如SSR、线粒体DNA序列、SNP等以及基因组测序对京东板栗资源现状进行进一步的研究，同时扩大样本采集范围，为今后保护及评估我国优质出口板栗资源、开发板栗经济品种、保障出口京东板栗的品质纯正、维护京东板栗在世界果品上的声誉提供基础研究。

参考文献

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表1 用于fAFLP分析的引物序列

Table 1 Primer sequences used for fAFLP analysis

表2 4对引物组合扩增结果

Table 2 Amplification results from 4 primers combinations

注: “ —”表示内容重复

表3 10个板栗群体的遗传多样性参数分析

Table 3 Genetic diversity parameters analysis of 10 chestnut populations

表4 10个板栗群体间相似度和遗传距离矩阵

Table 4 Nei’s genetic identity and genetic distance among 10 chestnut populations

注: 对角线上为遗传相似系数(N), 下为遗传距离(D)

基金项目：国家重点研发计划项目（2019YFC1605205）；青岛海关科研项目（QK201920）

第一作者：王小叶（1987—），女，汉族，山东烟台人，硕士，主要从事食品微生物检测工作，E-mail: wxy140701@163.com

通信作者：李正义（1981—），男，汉族，山东泰安人，博士，研究员，主要从事食品微生物检测工作，E-mail: lizhengyisdciq@163.com

1. 青岛海关技术中心 青岛 266109

1. Technology Center of Qingdao Customs, Qingdao 266109