王小叶 刘娟娟 殷培军 贾俊涛 姜英辉 唐静 吕宁 李正义

燕窝罐头是将处理过的燕窝装入小瓶等容器，经过高温高压杀菌后抑制微生物繁殖，从而长时间储存而不变质^[1]，是近年来市场上备受消费者追捧的热门产品。因其仿照罐头食品的生产工艺^[2]，对此类燕窝罐头的食品检测指标，应达到国家标准商业无菌的要求。商业无菌是罐头食品经过适度的热杀菌以后，不含有在常温下能在其中繁殖的微生物，也不含有致病微生物，这种状态称作商业无菌^[3]。

长期以来，罐头食品商业无菌的检测按照GB 4789.26—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 商业无菌检验》^[4]，将罐头在36℃保温10 d，罐头内如果有未被杀灭的微生物，会利用罐头本身的营养进行生长，引起产品感官变化、pH值变化，涂片镜检可在显微镜下观察到明显的微生物增殖现象，以判定样品为商业无菌或非商业无菌。此外，联合国粮农组织《罐头食品商业无菌常规检验法》、美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）和美国分析化学家协会（Association of Official Analytical Chemists, AOAC），对罐头食品的商业无菌检验都采用这种微生物学检验法。这种传统的方法虽然准确可靠，但是保温时间长、检测周期长、操作步骤多，不利于产品的快速通关，因此建立一种快速的检测方法十分必要。

美国食品药品监督管理局出版的《细菌分析学手册》第21章A：罐头食品检验，在附录中提到了一种快速气相色谱法作为测定腐败变质罐头的方法^[5]，将样品放入密闭的玻璃小瓶，将其气体部分（称作顶空）导入气相色谱（GC）的分离柱进行检测与定量。通过分析腐败变质罐头食品顶空中的二氧化碳、氢、氮、氧的数据表明，顶空气体中二氧化碳含量变化如果超过了临界值10%，则表明罐头内有微生物繁殖，二氧化碳的产生量足以使容器膨胀，高温储存加速了这种变化。气相色谱-质谱联用技术是近年来飞速发展的技术，可以高通量、快速检测细菌挥发性代谢物^[6-8], 一针进样完成对细菌挥发性代谢物的定性、定量。本文以FDA附录中的检测方法为理论依据，利用气相色谱-质谱联用技术检测燕窝罐头顶空中的二氧化碳，通过比较保温前后顶空中二氧化碳的含量变化来判断商业无菌。

1 材料与方法

1.1 测试样品

按照GB 4789.26—2013的检测方法判定为商业无菌的正常燕窝罐头以及判定为非商业无菌的腐败变质罐头。

1.2 仪器与试剂

安捷伦8890B-5977B气相色谱/质谱联用仪，仪器配有Agilent 7697A 顶空自动进样系统, 色谱柱使用Agilent CP7348PT PoraBOND Q PT （30 m×250 μm×3 μm），顶空进样瓶为20 mL，奥林巴斯显微镜BX53， 新加坡ESCO二级生物安全柜。

实验室用水为Milli-Q超纯水。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

1）保温前样品制备。燕窝罐头开启包装后，用灭菌吸管以无菌操作取出内容物至少5 mL至灭菌的顶空进样瓶内，顶空瓶封口后作为保温前检测，用顶空针抽取1 mL上层气体进样。

2）保温后样品制备。同时用灭菌吸管以无菌操作取出内容物至少5 mL至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口后36℃放置3 d，作为保温后检测，用顶空针抽取1 mL上层气体进样。

1.3.2 HS-GC-MS分析条件

1）顶空（HS）进样条件。加热箱温度：36℃，定量环温度：60℃，传输线温度：60℃，样品平衡时间：1 min，进样体积：1mL。

2）气相色谱（GC）条件。色谱柱（30 m×250 μm×3 μm），分流进样，分流比为70︰1，进样口温度：220℃ ，载气：高纯氦（He），流速：1.2 mL/min，色谱柱温度：40℃恒温保持5 min。

3）质谱（MS）条件。离子源EI，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，传输线温度230℃，电子能量70 eV，传输线温度230℃，采集模式全扫描，质量扫描范围m/z：20～300。

1.3.3 定性与定量

将试样注入气相色谱-质谱联用仪，设定自动识别信噪比＞100的色谱峰；质谱图的相似度≥80%的色谱峰，MS结果经计算机检索谱库（NIST）进行定性分析，同时由NIST MS Search 2.0软件系统完成手动对照检索，要求正反向匹配因子（Match）都大于800。采用提取离子流方式报告气体物质的峰面积，利用面积归一法计算，得到燕窝罐头食品试样顶空气体的含量。

罐头食品顶空气体的百分比Yi，按公式计算。其中，Yi：燕窝罐头中某种顶空气体占总顶空气体的百分比，单位为百分率（%）；As_i：燕窝罐头中某种顶空气体i的峰面积；ΣAs_i：燕窝罐头中所有顶空气体峰面积之和。通过测定相应峰面积对所有成分峰面积总和的百分数来计算给定组分i的含量，结果保留3位有效数字。

1.3.4 腐败变质罐头的分析

1）罐头食品保温前后顶空气体中二氧化碳含量未有显著增加，结果为阴性；罐头食品保温前后顶空气体中二氧化碳含量显著增加（峰面积百分比差值超过10%），表明有微生物繁殖，结果为阳性。

2）对仪器分析结果为阳性的试样，留样按GB 4789.26—2013中附录B进行异常原因分析试验并记录。

3）对仪器分析结果为阳性的顶空瓶试样打开，按GB 4789.26—2013附录B中的表B.1和表B.2的要求接种培养进行试验确认并记录。

2 结果与讨论

2.1 空气本底检测

取5 mL无菌水至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口后按照1.3.2节所述的条件检测空气本底气体组成，空气本底总离子流（TIC）质谱色谱图如图1所示，按照1.3.3节所述的定量方法计算空气本底中气体含量，其中含量低于2%，结果见表1。

图1 空气本底总离子流（TIC）质谱色谱图

Fig.1 Total ion flow (TIC) mass spectrum chromatogram of atmospheric background

表1 空气本底质谱色谱峰对应气体列表

Table 1 List of gases corresponding to air’s mass spectrum peaks of atmospheric background

2.2 正常和腐败变质燕窝罐头的顶空气体检测

国标方法检测为商业无菌的正常燕窝罐头以及非商业无菌的腐败变质燕窝罐头，按照1.3.1节所述的处理方法分别制备成保温前以及保温后的样品，经上机检测后，顶空气体总离子流（TIC）质谱色谱图如图2及图3所示。按照1.3.3节所述的定量方法计算出正常燕窝罐头以及腐败变质燕窝罐头在保温前后顶空气体含量，见表2、表3。

图2 正常燕窝罐头保温前后顶空气体总离子流（TIC）质谱色谱图

Fig.2 Total ion flow (TIC) mass spectrum chromatogram of normal canned bird’s nest before and after incubation

图3 腐败变质燕窝罐头保温前后顶空气体总离子流（TIC）质谱色谱图

Fig.3 Total ion flow (TIC) mass spectrum chromatogram of spoiled canned bird’s nest before and after incubation

表2 正常燕窝罐头保温前后质谱色谱峰对应气体列表

Table 2 List of gases corresponding to mass spectrum peaks of normal canned bird’s nest before and after incubation

表3 腐败变质燕窝罐头保温前后质谱色谱峰对应气体列表

Table 3 List of gases corresponding to mass spectrum peaks of spoiled canned bird’s nest before and after incubation

经过国标方法检测为商业无菌的燕窝罐头，保温前和保温后经GC-MS检测其二氧化碳含量分别为2.14%和1.96%，计算其差值（峰面积百分比差值）为0.18%，没有显著增加，结果为阴性，与国标方法检测结果一致，均为商业无菌。而国标方法检测为非商业无菌的燕窝罐头，保温后二氧化碳含量为17.2%，与保温前的2.25%相比，其差值为14.95%，燕窝罐头发生腐败变质前后二氧化碳峰面积差值超过10%，结果为阳性，与国标方法检测结果一致，均为非商业无菌。

2.3 腐败变质罐头的镜检

对腐败变质罐头按照GB 4789.26—2013进行显微镜镜检，可见有微生物繁殖，如图4所示。

图4 腐败变质燕窝罐头的镜检（×100）

Fig.4 Microscopy of spoiled canned bird’s nest (×100)

3 结语

目前对于罐头食品快检方法的尝试与应用中，相对成熟的有SN/T 2100—2008《罐头食品商业无菌快速检测方法》^[9]，其检测原理基于法国梅里埃的BacT/ALERT 3D 微生物检测系统^[10-11]，利用微生物代谢产生的二氧化碳为检测信号，将样品放置在底部有传感器的小瓶中，如果产生了二氧化碳，则传感器的颜色会发生变化继而被仪器检测到，该系统被用于魔芋罐头商业无菌快速检测方法的探索^[12]。除了二氧化碳，也有以活体微生物细胞的标记物ATP为检测信号的Promicol ATP微生物快检系统^[13]，以及以微生物代谢引起的电阻抗变化为信号的BacTrac4300自动快检系统等^[14]，这些微生物快检系统被探索用于UHT灭菌奶、低酸性罐头商业无菌的检测中，可将检测时间缩短至3 d。本实验综合了标准和文献报道，取5 mL的罐头内容物进行培养检测，实验过程中发现，有的燕窝罐头1 d就可以产生超过10%的二氧化碳，所有罐头最多3 d即可产生超过10%的二氧化碳，再增加培养时间不会增加检出率，因此将检测时间确定为3 d。本研究使用的顶空气相色谱质谱仪，现在大多数食品检测实验室都已经配置，有利于该方法在食品检测实验室的推广应用。另外，将质谱技术引入顶空气体的检测，二氧化碳具有特异性的指纹图谱，在样品成分分离后可以直接在谱库（NIST）中确认。本研究证明用顶空气相色谱质谱来检测燕窝罐头的商业无菌是可行的，全部检测可在3 d完成。但值得注意的是，有的罐头腐败不产生二氧化碳，这种快速检测方法局限在产生二氧化碳的腐败罐头，未来可在其他的罐头种类中，如水果罐头、肉类罐头等进行商业无菌快速检测的尝试，以克服检测周期长、操作繁琐等弊端，为食品安全提供科学的依据和指导。

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基金项目：武汉海关科研项目（2019WK004）

第一作者：郑剑（1981—），男，汉族，湖北黄冈人，硕士，高级工程师，主要从事物种鉴定工作，E-mail: 502873193@qq.com

通信作者：曾宪东（1979—），男，汉族，湖南益阳人，博士，高级工程师，主要从事分子生物学检测工作，E-mail: 25486409@qq.com

1. 武汉海关技术中心 武汉 430050

1. Wuhan Customs Technology Center, Wuhan 430050