陈晞 郑新华 陶琳 王乐 姜迪来 姚斌

基金项目：海关总署科研项目（2021HK200）

第一作者：陈晞（1982—），女，汉族，江苏射阳人，硕士，高级工程师，主要从事食品安全检测工作，E-mail: 377966613@qq.com

通信作者：王乐（1982—），女，汉族，山东淄博人，博士，研究员，主要从事食品中有毒有害物质检测与分析，E-mail: dingshen yong@163.com

1. 济南海关技术中心 济南 250014

2. 淄博海关综合技术服务中心 淄博 255000

3. 青岛大港海关 青岛 266012

1. Technical Center of Jinan Customs District, Jinan 250014

2. Comprehensive Technical Service Center of Zibo Customs, Zibo 255000

3. Qingdao Dagang Customs, Qingdao 266012

在饼干生产过程中，焦（低）亚硫酸盐是常见的食品添加剂，其主要作用为降低饼干面团中面筋筋力，改善面团的可塑性、延展性和稳定性，使饼干花纹清晰、口感酥松膨脆^[1-3]，同时还具有防止产品褐变、改善产品外观的作用^[4-5]。亚硫酸盐及其分解产生的二氧化硫具有较强刺激性，过量摄入亚硫酸盐可能引起恶心、呕吐、腹泻等胃肠道反应，甚至可能会对肝、肾、心脏等器官造成一定的危害，尤其会影响儿童的生长发育^[6-7]。

我国GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》对饼干中二氧化硫残留量均有严格限量，美国、日本等国家对此也有明确要求^[8-12]。GB 5009.34—2022《食品中二氧化硫的测定》规定了酸碱滴定法、分光光度法、离子色谱法3种不同测定方法，不同前处理或仪器分析所测得的结果存在不一致的问题，检测结果的准确性和重现性无法保证。基体标准物质对复杂基质样品的准确性、重现性和溯源性有着重要作用，当现有纯品标准品无法消除基质带来的干扰时，实验室需要采用相同基体标准物质进行质量控制^[13-14]。由于亚硫酸盐既有氧化性也有还原性的特点，在常温下会发生氧化还原反应，且热稳定性较差，在烘烤过程中容易分解为二氧化硫气体逸出，饼干中二氧化硫残留量标准物质制备有较大难度^[15-16]。因此解决样品的均匀性与稳定性问题，是本项研究的重点难点。课题组研制了饼干中二氧化硫残留量分析标准物质,依据JJF 1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》，对样品制备过程及样品均匀性、稳定性检验方法进行研究，给出标准物质的指定值，提供了合成扩展不确定度，这将对规范市场监管以及进一步完善我国食品添加剂标准物质体系起到显著作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

食品级小麦粉、白砂糖、黄油均购于市场。焦亚硫酸钠、30%过氧化氢溶液、甲基红指示剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。氢氧化钠标准滴定溶液：0.1 mol/L，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 主要仪器与设备

ST109B型二氧化硫测定仪：中国，济南盛泰公司；DZF-6250型真空干燥箱：中国，北京中科环试；XQM型立式半圆行星真空球磨机：中国，南北仪器有限公司；35KG密闭式干粉搅拌机：中国，郑州天弘公司；Genie G15型纯水机：中国，上海乐枫公司。

1.3 试验方法

1.3.1 饼干中二氧化硫的检测

采用食品安全国家标准GB 5009.34—2022中第一法酸碱滴定法进行检测：称取约20 g样品置于圆底烧瓶中，加水200 mL，安装好冷凝回流装置后，冷凝管上端玻璃导管置于100 mL指示剂中，用NaOH标准滴定溶液滴定至黄色。开通氮气，气流量1.5 L/min，蒸馏瓶内快速加入10 mL盐酸溶液，立即加热至沸腾，保持微沸1.5 h，停止加热。用NaOH标准滴定溶液滴定至黄色且20 s不褪，同时进行空白试验。

1.3.2 标准物质的制备

1）饼干样品按照黄油室温软化→搅打到细腻→加入糖粉搅打→加入焦亚硫酸钠溶液、低筋面粉→搅打均匀→成型切片→低温真空烘烤过程制备，参照产品生产工艺，在制作面团时加入焦亚硫酸钠溶液，最后获得含有二氧化硫的饼干样品。

2）将制备好的饼干样品分批投入立式半圆行星真空球磨机进行真空状态下球磨粉碎15 min，真空罐体选择不锈钢，研磨球选择氧化锆材质。研磨后的样品快速过100目孔筛，倒入密闭式干粉搅拌机，均匀混合20 min。

3）将混匀后样品分装至铝塑袋中真空封装，每袋约100 g，分装286袋，随机按顺序编号置于室温干燥处避光保存。

1.3.3 均匀性和稳定性评价

均匀性评价：依据JJF 1343—2012标准方法要求，对所制备饼干样品中二氧化硫残留量进行均匀性考察。随机抽取15份样品，每份样品准确称量（20.0±0.05）g，按照1.3.1节所述的方法对所抽取样品进行检测。每份样品分别取2个平行样品测定，采用方差分析法对全部检测结果进行检验。

稳定性评价：1）为考察运输过程、储存环境的不同温度对样品中二氧化硫残留量稳定性的影响，采用 t检验法对样品进行短期稳定性评价。设置运输极限时长为18 d，随机抽取10份独立包装饼干样品，平均分为2组，分别带包装置于40℃恒温箱和25℃恒温室中，在第 1天、第6天、第12天、第18天抽取样品测定样品中二氧化硫残留量，通过检验独立样品检测平均值的方法，评价样品在2个保存温度下的短期稳定性。2）为考察在规定的时间间隔内、规定的储存条件下，标准物质特性值的稳定性，项目组采用t检验法对样品进行长期稳定性检验^[17]。设定标准物质保存时间为18个月，在第1个月、第2个月、第4个月、第6个月、第9个月、第12个月、第15个月、第18个月对所制备的饼干标准物质进行8次二氧化硫残留量检测，每次随机抽取5份独立包装样品，每份样品测定1次，全部检测结果的平均值用于长期稳定性检验，同时进行感官性状检查，检查其是否存在霉变、生虫状态。

1.3.4 标准物质定值及不确定度确定

组织10家权威实验室参与标准物质联合定值，其中海关系统实验室8家、仪器设备生产厂1家、科研院所1家，分别采用GB5009.34—2022中所规定的酸碱滴定法、分光光度法、离子色谱法3种不同检测方法联合定值。每个定值实验室收到2份包装的饼干样品，每份样品平行测定3次，统计各实验室平行结果和平均值，采用格拉布斯法、柯克伦法等统计分析方法对定值结果进行检验，给出样品定值。依据标准 GB/T 15000. 3—2008《标准样品工作导则（3）标准样品 定值的一般原则和统计方法》对样品特征量值进行不确定度评估，给出样品合成不确定度。

2 结果与分析

2.1 样品制备方式研究

二氧化硫存在易挥发、易氧化还原的特性，在研究样品制备过程时首先应考虑将饼干烘焙制备完成，研磨为粉末，均质后添加焦亚硫酸钠粉末，二次均匀。直接添加焦亚硫酸盐制得样品的均匀性检验见表1，F值为19.32，远大于F_0.05(14,15) = 2.42，表明在0.05显著性水平时，该方式制备出的样品均匀性不好。因此，选择按实际生产工艺，在制备饼干面团阶段加入焦亚硫酸钠溶液，通过真空低温烘焙方式降低二氧化硫挥发和氧化还原影响，制成饼干成品后在真空条件下封闭研磨混匀。

表1 样品中直接添加亚硫酸盐均匀性检验结果

Table 1 Homogeneity test results of directly added sulfites in reference material

2.2 均匀性检验

均匀性检验方法取样量为20.0 g，饼干标准物质样品中二氧化硫均匀性测定和分析结果见表2， F值小于F_0.05(14,15) = 2.42，该标准物质样品中二氧化硫的均匀性良好。

表2 标准物质中二氧化硫均匀性检验结果

Table 2 Homogeneity test results of sulfur dioxide in reference material

2.3 稳定性检验

2.3.1 长期稳定性检验

对已通过样品均匀性检验的检测数据进行为期18个月的长期稳定检验，利用回归曲线对稳定性监测结果进行判断。结果见表3。

将表3中的数据进行线性拟合从而进行稳定性监测，以时间为X轴，以检测平均值为Y轴，用t检验法对基于斜率β₁的标准偏差S(β₁)进行判断。经计算，斜率β₁ = 0.0302，截距β₀ = 17.65，斜率的标准偏差S(β₁) = 0.0126，t_(0.05,7)·S(β₁) = 0.0309。该样品长期稳定性的t值均小于t_(0.05,7) = 2.31，β₁＜t_(0.05,7)·S(β₁)。通过感官性状检查，全部样品在18个月内均无生虫、霉变状态。检验结果可以证明，按1.3.2节所述方法制备的该标准物质中的二氧化硫残留量，在现有包装储存条件下，18 个月内是稳定的。

2.3.2 短期稳定性检验

短期稳定性采用一元线性回归法分析，检验样品在25℃和40℃的斜率的结果显著性验证见表5。当β₁＜t_(0.05,2)·S(β₁)时，可认为斜率不显著。由表4可见，该标准物质在常温和极限运输温度下短期稳定性均可满足需求。

2.4 检测机构联合定值结果

10家检测机构联合定值结果数据见表5。

通过偏态系数和峰态系数对10家实验室检测数据进行正态分布检验，当偏态系数A临界值A_(95%,80)，峰态系数处于B_(95%,75)区间时，认为数据服从正态分布。经检验，检测数据的偏态系数A = 0.215，峰态系数B = 2.326，查表可得临界值A_(95%,80) = 0.43，区间范围B_(95%,75)在2.27～3.87之间，所有检测数据均服从正态分布。

采用格拉布斯法检验全部结果数据是否存在可疑值。残差，当ν_i ＞ λ_{(α, n)}S时，该数据即视为可疑值，不参与定值统计。经检验，10家实验室全部检测数据与平均值的残差均小于λ_(0.05,6)S = 1.887，无可疑值，无需剔除。

采用柯克伦检验法对定值实验室重复测定的数据结果标准差最大值进行检验，从而评价定值数据的等精度。经检验，10家定值实验室检测结果的统计量值均小于临界值C_(0.05,10,6) = 0.2823，可证明参与定值的结果符合等精度数据要求。

再采用格拉布斯法对各组独立测定数据的平均值进行检验，判断组间数据差异的显著性水平。经检验，10组数据平均值的残差均小于λ_{(α, n)}S的值，可证明组间数据无显著性差异。

综上所述，10家联合定值机构全部检测结果均可参与定值，其总体平均值17.9 mg/kg即为饼干中二氧化硫标准物质的特征量值。

2.5 不确定度评定

从均匀性引入的不确定度(u_bb)、稳定性引入的不确定度(u_s)、定值过程引入的不确定度(u_char)等三方面合成饼干中二氧化硫标准物质定值结果的扩展不确定度。

2.5.1 均匀性引入的不确定度

在评定均匀性引入的不确定度(u_bb)时需要带入标准物质的均匀度和检测方法的重复性。用平行样品间标准偏差估计量S_bb反应平行样品间的不均匀程度，从而衡量标准物质的均匀度。用估计量u’_bb检验方法检测独立包装样品精密度程度。按照2.2节所述检验方法，将均匀性方差检验结果与所用方法的重现性及特性值的不确定度预期目标相比较，u_bb = S_bb =，为自由度。样品均匀性引入的相对不确定度U_rel(bb) = ，为结果平均值。经计算，样品均匀性贡献的不确定度u_bb = 0.15，其相对不确定度U_rel(bb) = 0.0083。

2.5.2 稳定性引入的不确定度

根据短期稳定性检验和长期稳定性检验实验结果，通过回归曲线方法分别计算出长、短期稳定性对于结果不确定度的贡献。根据表4和表5的计算结果，稳定性所贡献的不确定度u_s = S(β₁)·t。经计算，样品长期稳定性贡献的不确定度U_rel(s) = 0.0158。25℃短期稳定性不确定度u_rel = 0.00714，40℃短期稳定性不确定度u_rel’ = 0.00708，合成短期稳定性相对不确定度U_rel(sts) = 0.0100。

2.5.3 定值引入的不确定度

利用格拉布斯法对联合定值实验室各组间显著性差异进行检验，求得标准偏差S = 0.50，代入合成联合定值引入的不确定度U₀(char) = ，求得联合定值引入的不确定度U₀(char) = 0.15，其相对不确定度U_0rel (char) = 0.0083。

综上所述，通过合成定值过程引入不确定度U_rel(char)、均匀性引入不确定度U_rel(bb)、稳定性引入不确定度U_rel(s)和U_rel(sts)，确定了饼干中二氧化硫标准物质特征量值的扩展不确定度，合成公式如下：

式中，k = 2，m为各实验室定值结果的平均值，二氧化硫标准物质样品中合成扩展不确定度见表6。

表6 二氧化硫标准物质样品中合成扩展不确定度

（U_CRM，mg·kg^-1）

Table 6 Synthesized expanded uncertainty of sulfur dioxide in reference material (U_CRM，mg·kg^-1)

2.6 定值结果

在置信水平为95%，k = 2时，饼干中二氧化硫标准物质最终标准值为17.9 mg/kg，扩展不确定度为0.79 mg/kg。

3 结论

根据国际与国内监管要求，结合实验室检测和质量控制需求，本研究制备了饼干中二氧化硫残留量标准物质，创研样品生产加工工艺，降低了二氧化硫挥发性和氧化还原性对样品的影响，评价检验了所制备的样品均匀性和稳定性，进行了样品联合定值。所制备的饼干中二氧化硫残留量标准物质标准值17.9 mg/kg，扩展不确定度0.79 mg/kg（k = 2），均匀性、稳定性均可满足需求，为相关产品检测方法的开发与质量控制提供了参考依据。

参考文献

[1]周德庆, 张双灵, 辛胜昌. 亚硫酸盐在食品加工中的作用及其应用[J]. 食品科学, 2004(12): 198-201.

[2]苏伟政. 韧性饼干工业加工应用酶制剂替代焦亚硫酸钠解决方案[J]. 食品工业科技, 2015, 36(4): 44-45.

[3]时忠烈,时馨,肖晶.高空心度空心饼干生产配方及制作工艺的研究[J]. 粮油食品科技, 2020, 28(4): 132-137.

[4]马先红, 张铭鉴, 任静, 等. 杂粮饼干研究现状[J]. 食品工业, 2021, 42(6): 410-414.

[5] CHAGAS R, LAIA C A, FERREIRA R B, et al. Sulfur dioxide induced aggregation of wine thaumatin-like proteins: role of disulfide bonds[J]. Food Chemistry, 2018, 259: 166-174.

[6]张全喜, 孟紫强. 二氧化硫对大鼠离体心脏功能影响的机制研究[J]. 环境科学学报, 2012, 32(4): 968-973.

[7]苏立明, 池永学, 元熙哲, 等. 二氧化硫暴露对哮喘大鼠速发相反应影响[J]. 中国职业医学, 2010, 37(5): 376-378.

[8]黄丽,陈思伊,庞洁, 等. 食品中二氧化硫残留量检测研究进展[J].中国食品添加剂, 2020, 31(8): 123-128.

[9] Zaruba S, Vishnikin A B, Škrlíková J, et al. Using an optical probe as the microdrop holder in headspace single drop microextraction：Determination of sulfite in food samples[J]. Analytical Chemistry, 2016, 88(20): 10296-10300.

[10] NIETO C H D, GRANERO A M, LOPEZ J C, et al. Development of a third generation biosensor to determine hydrogen peroxide based on a composite of soybean peroxidase/chemically reduced graphene oxide deposited on glassy carbon electrodes[J]. Sensors and Actuators BChemical, 2018, 263(6): 377-386.

[11]冯亮, 高全利, 宋金丽, 等.滴定法测定食品中二氧化硫的不适用性及原因分析[J]. 食品安全导刊, 2023(25): 38-41.

[12] GB 2760—2014 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准[S]. 北京: 中国标准出版社, 2014.

[13]杨忠芳, 陈贻钢, 李宏盛, 等. 干百合中二氧化硫含量测定的不确定度分析[J]. 现代食品, 2023, 29(11): 198-201.

[14]黄凤娇. 分光光度法测定食品中二氧化硫含量的不确定度评定[J]. 食品安全导刊, 2023(21): 65-69.

[15] Wang X, Zhao W, Li L, et al. Fast and sensitive determination ofsulfur dioxide in herbal medicines by microchip-based field asym-metric-wave ion mobility spectrometry[J]. Analytical Methods, 2015, 7(3): 1036-1045.

[16]汪荷澄, 蒲云峰. 二氧化硫抗氧化能力及其在干果中的含量分析[J]. 食品研究与开发, 2019, 40(2): 22-26.

[17]王乐, 陈晞, 张欢欢. 明胶中总铅、总铬标准物质的研制[J]. 食品安全质量检测学报, 2021, 12(6): 2408-2415.

表3 标准物质中二氧化硫18个月稳定性测试结果

Table 3 Results of 18 month’s stability test of sulfur dioxide in reference material

注: “—”表示该数据不参与计算

表4 标准物质中二氧化硫短期稳定性测试结果

Table 4 Results of short-term stability test of sulfur dioxide in reference material

表5 定值结果数据统计

Table 5 Data statistics of fixed value results