郭雨 施亚申 吉如娜

Abstract An isotope internal standard method was established to determine residues of fosety-aluminum and its decomposition products, ethylphosphoric acid and phosphonic acid, in peanuts and pumpkin seeds. The samples were extracted with acidified methanol, frozen centrifuged, and purified with C18. Separation was achieved using a Hypercarb chromatographic column, and detection was performed with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), followed by quantification using the dilution isotope internal standard method. In the concentration range of 6.25-250 ng/mL for ethylphosphoric acid and phosphonic acid, the linear equations had coefficients (R²) greater than 0.999. The detection limits for ethylphosphoric acid and phosphonic acid were both 0.05 mg/kg. At three different levels of 0.05 mg/kg, 0.15 mg/kg, and 0.50 mg/kg, the recoveries of ethylphosphoric acid and phosphonic acid in peanuts and pumpkin seeds ranged from 88% to 106%, and the relative standard deviations of the results from six experiments were between 8.5% and 12.0%. This method has the advantages of simple sample pre-treatment, short analysis time, low consumable cost, accurate results and good stability. It can meet the requirements for the determination of residues of fosety-aluminum and its decomposition products, ethylphosphoric acid and phosphonic acid, in peanuts and pumpkin seeds.

Keywords diluted isotope internal standard; fosety-aluminum; ethylphosphoric acid; phosphonic acid

三乙膦酸铝是一种有机磷类具有内吸性和低毒性的杀菌剂，既能通过根部和基部茎叶吸收后向上输导，也能从上部叶片吸收后向基部叶片输导，对蔬菜、果树霜霉病、菠萝心腐病、茎溃病、红髓病有效，因此广泛应用于农业生产中。

欧盟法规Reg.（EU）2022/1324规定了各类农产品中三乙膦酸铝的最大残留限量，其中花生和南瓜籽的最大残留限量均为2.0 mg/kg。花生和南瓜籽常被做成花生酱、南瓜籽油等高附加值产品出口至欧盟，但对于三乙膦酸铝的残留国内尚无相关检测标准，这对于企业自身产品的内部质量管控以及产品是否符合欧盟的要求是一个难题，因此制定简便、可靠的检测方法迫在眉睫。

根据JAP检测方法^[1]，采用三甲基硅烷重氮甲烷衍生后通过气相火焰光度检测器检测或气相色谱串联质谱测定分析磷乙铝、亚磷酸的含量，计算三乙膦酸铝的总含量，因该方法前处理复杂、所用试剂重氮甲烷毒性大，且衍生化程度不易控制，结果稳定性不能保证。采用离子色谱法^[2-3] 大多检测的是三乙膦酸铝原药或含量较高的产品，且检测方法的准确性和稳定性易受前处理过程的影响。采用气相色谱法和高效液相色谱法等分析方法^[4-6]的检出限较高，不适合日常实验室的样品检测。

根据国家相关标准^[7]，三乙膦酸铝的残留物包括乙基膦酸和亚磷酸及其盐之和，用乙基膦酸表示，现有文献未见采用稀释同位素内标法检测油料作物花生和南瓜籽中三乙膦酸铝的报道。本研究建立了同位素内标法测定花生和南瓜籽中三乙膦酸铝及其分解产物乙基膦酸和亚磷酸的残留量，以期满足花生和南瓜籽中三乙膦酸铝及其分解产物乙基膦酸和亚磷酸的残留量检测要求。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

超高效液相色谱串联质谱仪：AB 5500+（美国AB Sciex公司）；Vortsx 3高速涡旋仪（德国IKA公司）；X3R（美国赛默飞公司）；5000系列往复式振动摇床（美国Talboys公司）。

三乙膦酸铝标准品（50 mg，95%，Tmstandard公司）；亚磷酸标准品（250 mg，97%，Tmstandard公司）。

三乙膦酸铝-D₁₅标准品（10 mg，98.5%，德国Dr.ehrenstorfer公司）；亚磷酸-¹⁸O₃标准品（2 mg/mL，ISOREAG公司）；甲酸（HPLC级）、甲醇（LC-MS级）、C18吸附剂材料，均来自上海安谱公司；EDTA（AR，国药集团）。实验用水为美国密理博Millipore制备一级水。

1.2 分析方法

1.2.1 提取与净化

称取(5±0.05) g样品，加入9 mL水，1 mL 10% EDTA水溶液，涡旋摇晃1 min，加入10 mL酸化甲醇（含1%甲酸）和40 μL的含有同位素内标的混合溶液（0.010 mg/mL），再加入100 μL甲酸，加盖，摇晃几秒钟，用自动摇床摇15 min。-5℃冷冻30 min，4700 r/min冷冻高速离心5 min，取2 mL上清液转移到含有2 mL乙腈和100 mg C18吸附剂的10 mL离心瓶中，摇匀1 min，3000 r/min离心5 min，取上清液经0.22 μm滤膜过滤到进样瓶中，待检测。

1.2.2 仪器分析条件

色谱条件Hypercarb色谱柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；柱温40℃，流速0.4 mL/min；进样量5 μL；流动相A：1%甲酸水+5%甲醇，流动相B：1%甲酸甲醇。洗脱梯度：0～10 min，A从100%～70%，10.1 min，A变成100%，保持5 min。

质谱条件离子源类型：电喷雾离子源负离子扫描（ESI^-），电喷雾电压为-4500 V，离子源温度为350℃，雾化气为0.345 Mpa，辅助加热器为0.345 Mpa，多反应监测（MRM）。

1.2.3 标准溶液的配置和标准曲线制备

用甲醇溶解三乙膦酸铝、亚磷酸标准品，分别配置成1.00 mg/mL标准储备溶液，再用乙腈稀释成0.010 mg/mL中间储备液，有效期3个月；用甲醇溶解三乙膦酸铝内标标准品，配置成2.00 mg/mL标准储备溶液。

混合标准工作溶液：将0.010 mg/mL三乙膦酸铝、亚磷酸用乙腈稀释成1 μg/mL，临用前混合，有效期7 d；将2.00 mg/mL三乙膦酸铝内标、亚磷酸内标用乙腈稀释成0.010 mg/mL，临用前混合，有效期3个月。

使用合适的空白样品（不含任何相关的分析残留物），分别添加0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg质量浓度混合标准工作溶液，按照1.2.1节中所述进行样品提取和净化，得到基质匹配标准曲线。

1.2.4 三乙膦酸铝含量的计算

根据JAP的检测方法，三乙膦酸铝的残留量可以通过分解产物乙基膦酸和亚磷酸计算，三乙膦酸铝含量=乙基膦酸含量+1.44×亚磷酸含量。

1.2.5 添加回收试验

分别在花生和南瓜籽空白样品中添加1倍、3倍、10倍检出限浓度的三乙膦酸铝标准溶液，即0.050 mg/kg、0.15 mg/kg、0.50 mg/kg，按照1.2.1节所述方法每个浓度水平进行6次平行实验，计算回收率和精密度。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

根据三乙膦酸铝的分解产物为乙基膦酸和亚磷酸，通过结构式发现，在质谱中应该为负离子电离，失去H⁺,如图1所示。

图1 三乙膦酸铝的分解产物、乙基膦酸和亚磷酸的结构式

Fig.1 Structural formula for decomposition products of fosety-aluminum, ethylphosphoric acid and phosphonic acid

经过质谱的优化分析，得到离子对信息，见表1。

表1 离子对信息表

Table 1 Information of ion pairs

注: 三乙膦酸铝实际检测对象为乙基膦酸, 三乙膦酸铝D₁₅检测对象为乙基膦酸D₅

2.2 色谱条件的优化

在农药残留检测方法中，三重四极杆质谱仪可以通过多通道MRM模式，即使两个物质的保留时间相近^[8-9]，也可通过母离子和子离子的不同对被分析物进行定性和定量。但是经过标准溶液测试方法发现，三乙膦酸铝及其类似物会通过源内裂解为亚磷酸，需要在色谱上将乙基膦酸和亚磷酸分离后消除对亚磷酸定性和定量的影响，因此，色谱柱的选择尤为关键。

乙基膦酸和亚磷酸均为强极性化合物^[10-12]，在普通C18或者HILIC色谱柱上无任何保留，因此通过比较发现，选用Hypercarb色谱柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）能够对强极性化合物有所保留。乙基膦酸和亚磷酸为酸性化合物易与金属离子结合，两者相互作用，导致乙基膦酸和亚磷酸在洗脱的过程中出现峰形拖尾，为此，在流动相中应添加适当浓度的甲酸，可以有效避免峰形的拖尾，但与此同时也会抑制目标化合物的电离程度，从而影响化合物的响应值。对比添加不同浓度的甲酸试验，可以发现添加1%甲酸时，能有效避免色谱峰形拖尾，同时尽量减少对乙基膦酸和亚磷酸响应值的影响。通过色谱条件优化后得到乙基膦酸和亚磷酸的质谱图（图2）。

2.3 提取与净化分析

2.3.1 提取

通常花生和南瓜籽类样品本身含水量＜10%，当加入适当的水后，植物的细胞能够充分地张开，容易在有机试剂提取过程中与目标化合物充分接触，增加提取效率。添加一定浓度的乙二胺四乙酸 （EDTA）是为了与金属离子（如钙和镁）络合，从而消除金属离子对化合物分析时的干扰。

2.3.2 冷冻离心的选择

花生和南瓜籽的油脂含量分别为44%～45%和27%，属于含油量高的食品。当加入水后会形成乳浊液，如果直接高速离心则不利于分离，通过预先冷冻即可以凝固部分脂肪层，易于后续的离心和分层。

2.3.3 净化分析

当采用冷冻离心后，提取溶液中依然残留部分蛋白和油脂，通过再次加入乙腈沉淀蛋白后，再加入C18吸附剂去除油脂，净化待测溶液。

2.4 方法的线性和检出限

乙基膦酸和亚磷酸在6.25～250 ng/mL的浓度范围内，线性的相关系数R²＞0.999，乙基膦酸和亚磷酸的检出限均可以达到0.05 mg/kg，在现有国家标准中，苹果、葡萄、荔枝和黄瓜三乙膦酸铝最大限量值分别为30 mg/kg、10 mg/kg、1 mg/kg、30 mg/kg，本方法检出限符合国家相关标准对于相关产品的限量要求，满足日常检测需要。

2.5 方法的准确度和精密度

在0.05 mg/kg、0.15 mg/kg和0.5 mg/kg 3个梯度加标水平下，花生和南瓜籽中乙基膦酸和亚磷酸的回收率在88%～106%之间，6次相对标准偏差在8.5%～12%之间（表2）。

表2 花生和南瓜籽中乙基膦酸和亚磷酸的回收率和相对标准偏差

Table 2 Recoveries and relative standard deviations of ethyl-phosphonic acid and phosphite acid in peanuts and pumpkin seeds

注: 三乙膦酸铝检测对象为乙基膦酸

3 结论

本研究建立了一种同位素内标法测定花生和南瓜籽中三乙膦酸铝及其降解产物乙基膦酸和亚磷酸残留量的检测方法。针对含油量较大的农产品检测，无需按照常规检测方法使用大量有机试剂提取，提取后的样液通过固相萃取小柱净化，净化液氮吹浓缩后检测，采用该方法减少了试剂和耗材的使用，降低了对环境的危害，提高了检测工作的效率。样品经1%甲酸甲醇提取，冷冻离心除脂，100 mg C18吸附剂材料净化，Hypercarb色谱柱分离，液相色谱串联质谱分析，稀释同位素法定量。该方法对环境友好，检测时间短、操作速度快、检测耗材成本低，方法的灵敏度、精密度和准确性都相对较高，能满足花生和南瓜籽中三乙膦酸铝及其分解产物乙基膦酸和亚磷酸的残留量的检测要求。

参考文献

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图2 乙基膦酸和亚磷酸的质谱图

Fig.2 Mass spectra of ethylphosphoric acid and phosphonic acid

基金项目：宁波市科技计划项目（202002N3114，2021S195）

第一作者：史红兰（1973—），女，汉族，浙江嵊州人，本科，工程师，主要从事食品接触材料及制品检测方法研究，E-mail: 1020745054@qq.com

通信作者：朱晓艳（1978—），女，汉族，浙江兰溪人，博士，研究员，主要从事食品接触材料、消毒产品法规研究、项目研发，E-mail: zhuxy@nbyjg.com

1. 宁波中盛产品检测有限公司 宁波 315000

2. 宁波市疾病预防控制中心 宁波 315000

3. 宁波海关技术中心 宁波 315000

4. 宁波检验检疫科学技术研究院 宁波 315000

1. Ningbo Joysun Product Testing Service Company, Ningbo 315000

2. Ningbo Center for Disease Control and Prevention, Ningbo 315000

3. Ningbo Customs Technology Center, Ningbo 315000

4. Ningbo Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine, Ningbo 315000