刘培海 相湛昌 林令海 李大伟 王凯 雷质文 李林杰

根据世界卫生组织（WHO）的统计，全球因食源性疾病导致的患者中，70%以上病因是食品或饮用水受到微生物污染^[1]。食源性致病菌污染带来的疾病正成为食品安全工作的重点，也是被广泛关注的公共安全问题^[2‒3]。食源性致病菌不仅对人体健康造成严重危害，而且会造成严重的经济损失。食源性疾病暴发的主要原因在于检测和控制措施滞后，且易造成大面积流行，引起多数人染病。食源性致病菌传统的检测方法主要是通过增菌、分离、形态观察、生化鉴定以及血清学分型等方式来鉴定，步骤繁琐、检测周期较长，无法满足快速检测的需求，还会延误食源性疾病采取控制措施的最佳时机。

在过去的20年里，随着全基因组测序的完成，核酸扩增技术作为分子生物学的核心得到了迅猛发展和广泛应用。特别是在疾病的临床诊断中，核酸扩增技术以其快速、灵敏和特异的优势，不仅日益取代了传统的鉴定方法，而且许多针对特异病原体的检测方法已经开发为试剂盒并进入常规检测。根据反应条件不同，核酸扩增技术可以分为两大类：非等温扩增技术和等温扩增技术，分别以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）为代表。LAMP方法操作简单、快速、灵敏度高，不仅适用于实验室检测，也适用于基层检验检测机构和现场检测等^[4]。LAMP方法克服了PCR方法需要专用的PCR仪的问题，在食源性致病菌的检测中得到了广泛应用。

1 LAMP技术介绍

1.1 LAMP技术原理

LAMP技术是2000年由日本学者Notomi等^[5]建立的一种等温核酸扩增技术的快速检测方法，其原理为选取靶基因的6～8个区域设计4～6条特异性引物，使用链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒定温度下孵育，1 h即可完成反应。通常根据靶基因保守区序列设计4条引物，包括2条内引物（FIP、BIP）和2条外引物（F3、B3）。FIP包括F1C（与靶基因模板链上3′端F1C区序列相同）和F2（与模板链上3′端F2C区序列互补），BIP包括B1C（与靶基因模板链上5′端B1C区序列相同）和B2（与模板链上5′端B2C区序列互补）。反应开始阶段，4条引物都参与扩增，后期循环反应中只使用内引物进行置换链DNA合成。具体扩增程序是：FIP中的F2与模板链上F2C结合开始，在聚合酶作用下扩增，F3引物与目的片段互补区域F3C部位结合，开启扩增反应FIP互补链释放出来；由于F1C和F1互补，释放的单链在5′端形成茎环结构，这条释放的单链可以作为内引物BIP的模板进行DNA合成，与上述步骤相似，BIP中的B2与模板链上与之互补的B2C序列结合，B3与B3C结合开始扩增并置换BIP合成链，最后形成两边都有茎环哑铃结构的产物；哑铃结构迅速通过内引物以单链为模板启动DNA扩增成为茎环结构，该茎环结构即下一循环的模板材料，开始新一轮扩增反应，最终形成长度不一的茎环结构和拥有多个环的花椰菜形状的结构的混合物。

1.2 LAMP引物设计

根据LAMP引物设计的原则，用在线Primer Explorer4.0（网址：http://primerexplorer.jp/e）在靶基因序列保守区设计4条引物（FIP、BIP、F3、B3）。应用NCBI提供的Blast软件比较引物序列，从而获得特异性引物。靶基因序列中GC含量高时，引物的GC含量应在50%～60%之间；序列中AT含量高时，引物的GC含量应在40%～50%之间。引物设计不应形成二级结构，引物的3′末端不能为AT富集区或者与其他引物互补。此外，GC含量高时，引物区的Tm值约60～65℃，AT含量高时，Tm值应为55～60℃。同时，F1C和B1C的Tm值应该高于F2和B2的Tm值，使得当单链释放时容易形成环状结构^[6]。

2 LAMP技术特点

PCR方法、荧光定量PCR方法是食源性致病菌快速检测的主要方法，与PCR方法相比，LAMP方法具有特异、灵敏、扩增效率高、对设备要求低等优点。LAMP方法与PCR方法、荧光定量PCR方法的比较见表1。

除LAMP方法外，其他的等温扩增技术也已陆续得到开发和应用，包括链置换等温扩增技术（strand displacement amplification，SDA）、滚环核酸扩增技术（rolling circle amplification，RCA）、重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）、解旋酶依赖扩增技术（helicase-dependent amplification，HDA）、依赖核酸序列扩增技术（nucleic acid sequence based amplification，NASBA）^[10-12]。与其他等温扩增技术相比，LAMP方法特异性高、成本低，而且不受基质中抑制剂的影响，LAMP方法与其他等温扩增技术的比较见表2。

3 LAMP反应产物分析方法

随着LAMP技术的应用，LAMP产物分析方法也经历了从简单到复杂、从定性到定量、从单一方法到复合方法的转变。早期的研究中，LAMP反应产物的分析方法主要通过肉眼观察如浊度法、荧光染料法。随着LAMP方法和其他技术的结合，实现了产物分析方法的定量化、可视化、快速化。

3.1 浊度法

LAMP反应结果可通过直接观察是否产生焦硫酸镁沉淀来判断^[13-14]。LAMP扩增过程会产生大量的焦磷酸根离子，利用核酸扩增过程中生成的焦磷酸根离子和反应体系中镁离子反应产生沉淀的方式来观察结果，肉眼观察是否有白色沉淀即可确定是否有扩增产物。也可使用浊度计来实时检测反应产生的白色沉淀进而监控反应产物的变化。该方法简单、快速、直观，但灵敏度低、特异性差。

3.2 荧光染料检测法

LAMP扩增反应结束后，反应体系中加入SYBR GreenⅠ等荧光染料，SYBR GreenⅠ染料能够结合DNA双螺旋结构，在可见光或者紫外下观察颜色变化，如果含有扩增产物，颜色变为绿色，如果没有扩增产物，颜色不变^[15]。该方法简单、快速，实现了可视化检测，但扩增后开盖加入染料容易导致扩增产物气溶胶污染，造成假阳性结果。

3.3 金属指示剂法

LAMP反应管中加入金属指示剂如钙黄绿素、羟基萘酚蓝等，扩增过程中观察颜色变化。以羟甲基萘酚蓝作为指示剂，若目的序列发生扩增，则反应液呈蓝色（阳性反应），反之反应液呈紫色（阴性反应）。该方法可实时观察反应状态，避免反应完成后开盖造成的气溶胶污染，但反应体系中加入的部分金属指示剂可能抑制扩增反应，影响扩增效率^[16-17]。

3.4 琼脂糖凝胶电泳法

琼脂糖凝胶电泳是分离和检测核酸的常用方法，取扩增后的LAMP产物进行琼脂糖凝胶电泳，由于阳性的LAMP扩增产物为长短不一的茎环结构片段，凝胶电泳结果显示为大小不同的梯度条带，以此判断是否检测到目标产物。该方法克服了间接方法如浊度法、染料法等的非特异性问题，降低了非特异性检测的风险^[18]，但是电泳条带不能区分单个基因还是多个基因，还需其他方法进行分析验证。

3.5 LAMP-LFD方法

LAMP-侧向层析法（lateral flow dipstick，LFD）是LAMP技术与侧向层析方法相结合的技术，该方法设计引物时，需在FIP引物5′端进行生物素标记，还需设计FITC标记的DNA探针。DNA探针是根据FIP和BIP引物之间的基因序列来设计，并在5′端进行FITC标记，通过生物标记的扩增产物和FITC标记的探针杂交来检测扩增产物。LAMP-LFD方法简便直观、特异性好、灵敏度高，不需要特殊的仪器设备，可满足现场检测需求，但存在一定的假阳性，而且批次之间结果不稳定^[19]。

3.6 LAMP-ELISA方法

LAMP-酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法是将抗原标记的核苷直接加入到LAMP扩增产物中，然后与特异性寡核苷酸探针杂交，最后通过免疫分析技术检测捕获的扩增产物。LAMP-ELISA方法可同时检测几百个样品，仅需几个小时。该方法无需贵重的设备，且基于生物识别来检测目标产物，比其他间接方法特异性高、检测效率高^[20]。

3.7 生物发光法

生物发光法是通过实时监测方法持续监测焦磷酸含量的动力学变化，时间可长达2 h。在LAMP反应中，达到生物发光峰值的时间取决于目标DNA的初始浓度，可通过一组已知浓度的对照品获得。实时监测生物发光方法可通过测量到达发光峰值的时间来获得，不依赖于光浓度，大大降低了对数据处理和硬件的要求^[21]。

3.8 其他方法

其他方法如生物传感器法、生物芯片法、CRISPR/Cas技术也陆续被报道用于LAMP产物的分析检测，方法特异性高，但反应成本较高、耗时较长。

4 LAMP技术在食源性致病菌快速检测中的应用

LAMP技术特异性强、扩增效率高，且具有较高的灵敏度，尤其适合以定性检测为目标的食源性致病菌检测。LAMP技术已广泛应用于几种主要的食源性致病菌检测与研究。

4.1 沙门氏菌

沙门氏菌（Salmonella）是常见的一种食源性致病菌，是造成食源性感染暴发的主要原因。对食品中沙门氏菌的常规检测需进行分离培养、生化反应和血清学确认，整个过程至少需要5 d。近年来，研究人员对沙门氏菌快速检测方法进行了大量研究，开发出了一批基于LAMP技术的沙门氏菌快速检测方法。这些方法的靶基因包括invA、fimY、stn、ssi、STY2879等，灵敏度比普通PCR方法高10～100倍。2005年，Yukiko Hara-Kudo等^[22]第一次将LAMP技术应用于沙门氏菌的检测，以invA基因为靶基因，采用浊度法和实时荧光方法为分析方法建立了沙门氏菌快速检测方法，并将其应用于液态蛋样品的检测，人工污染样品的检测限可达到2.8 CFU/反应。王羽等^[23]应用LAMP方法检测肉及肉制品中的沙门氏菌，针对沙门氏菌的特异基因invA设计4条引物进行LAMP扩增，并对48份样品进行实际检测，阳性符合率为93.8%，检测时间为1.5 h。Siyi Chen等^[24]研究了叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，PMA）偶联环LAMP技术检测沙门氏菌活细胞的方法，对纯培养的沙门氏菌，检测灵敏度为3.4～34 CFU/反应，人工污染样品为6100～61000 CFU/反应，灵敏度均比PMA-PCR高100倍以上，实现了基于LAMP技术的沙门氏菌活细胞的检测。

4.2 单核细胞增生李斯特氏菌

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种人畜共患菌，在自然界中广泛存在，当牲畜感染后会随着食物链导致人类感染。单核细胞增生李斯特氏菌是李斯特菌属中唯一感染人的致病菌，尤其对免疫力低下的老人、儿童、孕妇等人群，能在4℃下生存，在许多条件下不同产品中可形成生物膜，是冷藏食品和即食食品污染的重要病原菌 ^[25]。2001—2019年，共有20余篇基于LAMP技术的单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法文献，靶基因分别涉及hlyA、plcB、prfA、actA、iap基因。Mengjun Tang^[26]等以hlyA为靶基因，设计6条引物，以凝胶电泳和荧光染料为分析方法，建立了基于LAMP技术的单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法，检测灵敏度比普通PCR方法高100倍，并将该方法用于60份鸡肉样品检测，与传统的培养方法检测准确的一致性为100%。徐匆等^[27]以hlyA基因为靶基因建立了反转录LAMP快速检测方法，可快速检测样本中是否存在单核细胞增生李斯特氏菌的RNA，检测灵敏度是RT-PCR方法的10倍，将方法用于牛奶检测，可检测牛奶中是否存在单核细胞增生李斯特氏菌活菌，具有重要的实用价值。易海华等^[28]建立了食品中单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP检测方法，并对荧光定量LAMP进行了初步研究。该方法可以在0.5 h内完成，灵敏度比普通PCR高100倍以上，检出限达17.2 CFU/反应；定量检测中，反应时间与初始模板浓度的对数值有较好的线性关系（R² = 0.9994）。叶宇鑫等^[29]以特异基因gyrB为靶基因，设计4条引物进行LAMP扩增，1 h内完成检测，方法灵敏度达到64 CFU/反应，特异性强，与其他常见细菌无交叉反应，对人工污染牛奶样品进行检测，检出限为1 CFU/mL，比普通PCR灵敏度高100倍以上。

4.3 副溶血性弧菌

副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）是一种革兰氏阴性兼性厌氧嗜盐菌，存在于海岸、盐湖及海产品中，是海洋水体及海洋生物的主要致病菌之一，也是水产品进出口检测的主要食源性致病菌。针对副溶血性弧菌的保守基因tlh、tdh、toxR、gyrB、groEL，研究人员开发了多种LAMP检测方法。张蕾等^[30]采用纳米磁珠分离副溶血性弧菌，结合LAMP技术，建立了副溶血性弧菌快速检测方法，纯培养、无需增菌情况下，检测灵敏度达到140 CFU/mL，对208株菌进行特异性测试，无假阴性和假阳性问题，具有良好的特异性。Yi Wang等^[31]分别以toxR和rpoS为靶基因，采用熔解曲线方法为分析方法，同时检测副溶血性弧菌和创伤弧菌，反应温度为62℃，最快可以19 min观察到阳性结果，对副溶血性弧菌和创伤弧菌检测的灵敏度分别为250 fgDNA/反应和125 fgDNA/反应，灵敏度分别为普通PCR方法和荧光定量PCR方法的100倍和10倍。Wataru Yamazaki等^[32]以副溶血性弧菌耐热性溶血毒素基因（tdh）以及与之相关的基因（trh1，trh2）为靶基因，设计4条引物建立了副溶血性弧菌的LAMP检测方法。结果表明携带tdh、trh1和trh2基因的125株副溶血性弧菌LAMP反应均为阳性，虾样品中检测tdh、trh1和trh2基因检测灵敏度分别为0.8 CFU/反应、21.3 CFU/反应和5.0 CFU/反应。

4.4 大肠杆菌O157:H7

大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）是一种主要的出血性大肠杆菌，食入较低浓度（10～100 CFU）的细菌即可引起疾病^[33-34]。目前国内检测方法依然采用传统培养分离、生化鉴定以及血清学实验等方式，周期5～7 d，不能适应快速检验需要，尤其是在大规模暴发时无法及时提供可靠结果。因此，快速、灵敏度高、特异性强的检测方法成为O157:H7防控的研究热点，LAMP技术正好满足这一要求。2000—2019年，基于LAMP技术的大肠杆菌O157:H7快速检测方法的文献有10余篇，主要涉及的靶基因包括rfbE、stx1、stx2、fliC基因。Jin-Hee Kim等^[35]基于膜过滤浓缩技术、侧向免疫层析技术，以stx2基因为靶基因，建立了大肠杆菌O157:H7的LAMP快速检测方法，解决了低浓度样品的快速检测问题，将该方法用于人工污染的牛肉样品检测，过滤浓缩样品的检测限可达10 CFU/g，灵敏度比未浓缩样品高10倍。Gökhan Kürşad Incili^[36]等将大肠杆菌O157:H7的LAMP方法与ISO 16649方法及VIDAS初筛方法进行了比较，LAMP方法无论是特异性还是灵敏度，均高于其余两种方法，而且LAMP方法所需检测时间少。梁玉林等^[37]以rfbE基因为靶基因，建立了检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光反转录LAMP方法，并将该方法用于人工污染脱脂乳样品的检测，检测限达到20 CFU/g，灵敏度比RT-PCR方法高10倍，为实现大肠杆菌O157:H7活菌的现场快速检测提供了技术支撑。

5 应用前景及展望

环介导等温扩增技术（LAMP）特异性强、灵敏度高、扩增效率高，尽管原理较为复杂，但操作较为简单，且对设备要求不高，特别适合基层检验检测机构使用。然而LAMP技术也有不足之处，主要包括以下三方面：一是由于其扩增效率高，因而出现假阳性的几率也较高，尤其是使用琼脂糖凝胶电泳检测，反应体系打开过程很容易引起污染，造成假阳性。可通过严格分区、实验过程设置空白对照等方式降低污染风险^[38-39]。二是由于LAMP方法产物分析的大部分方法为间接方法，如浊度法、荧光染料法，无法区分是一种基因还是多种基因，涉及多基因时还需采用酶切分析或者熔解曲线方法才能确定，增加了方法的复杂性。三是标准方法较少，且协同实验较少。方法验证是新方法能够被采用进行常规应用的一个关键步骤。这些方法验证应满足国际标准导则，然后方法才能应用在食品和饲料的常规检测中^[38]。尽管基于LAMP技术的食源性致病菌检测方法开发及应用发展迅速，但是按照国际标准进行方法验证的研究还较少。这些验证研究包括单一实验室验证、独立实验室、协作研究（国际），以及检测方法的包容性、排他性、灵敏度和在食品或饲料基质中检测的可能性。随着LAMP扩增技术研究的深入，LAMP技术快速、灵敏、高效的特点将在食源性致病菌的检测中发挥更大优势，为基层检验检测及现场检测提供技术支撑。

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表1 LAMP方法与PCR方法、荧光定量PCR方法的比较

Table 1 Comparison of LAMP, PCR and fluorescence quantitative PCR

表2 LAMP方法与其他等温扩增技术方法的比较

Table 2 Comparison of LAMP and other isothermal amplification methods