鹦鹉热衣原体分子检测技术研究进展-中国口岸科学技术-2023年12期

鹦鹉热衣原体分子检测技术研究进展

作者：苏博史梅梅杨俊谢晓倩王昱汪琳曾艳聂福平

苏博史梅梅杨俊谢晓倩王昱汪琳曾艳聂福平

鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci，C. psittaci）是衣原体目、衣原体科、衣原体属成员，革兰氏阴性、专性细胞内寄生细菌^[1]。由于该病原可通过气溶胶传播，其传播能力较强，目前C. psittaci已广泛存在于世界各地^[2-4]。不同宿主呈现出不同的症状，典型症状有嗜睡、高热、厌食并伴随结膜炎、流涕等。据我国学者2013年报道的国内动物感染鹦鹉热情况显示，不同品种的家禽、鹦鹉、鸽子、雀等禽类都是C. psittaci的易感动物，但流行率不同^[5-6]。然而C. psittaci再次引发关注并非因为发现新的宿主，而是由于C. psittaci感染人的报道数量越来越多^[7-8]，部分患者还产生了较为严重的症状^[9-11]。2022年我国学者报道C. psittaci可能具备人传人的能力^[12]。C. psittaci的早期诊断是该病防控重要手段之一，准确的检测结果对控制病原的传播起重要作用，分子诊断凭借其较快的检测速度和较高的灵敏度，迅速成为病原检测的热门方法。近年来衣原体的分类被不断更新，检测技术也不断发展，本文对近年来C. psittaci的分子检测方法进行梳理，为该病原的检测提供方法，也为快速检测技术的发展提供参考。

1 鹦鹉热衣原体简介

美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库显示，目前衣原体属有18个衣原体种。其中，鹦鹉热衣原体（C. psittaci）、流产衣原体（Chlamydia abortus，C. abortus）、猫衣原体（Chlamydia felis，C. felis）、猪衣原体（Chlamydia suis，C. suis）等是较为常见的感染动物的衣原体^[13]。目前研究认为，根据编码衣原体外膜蛋白A（Outer membrane protein A，ompA）基因，C. psittaci被分为至少9种基因型，包括A、B、C、D、E、F、E/B、M56和WC^[14]。不同基因型的易感动物和毒力都不同。A、B型多感染鸽子和鹦鹉目鸟类，C型感染鸭和鹅，D型一般感染火鸡，E型存在于鸽子、鸭子等动物中，F型存在于火鸡和长尾小鹦鹉中，E/B型能感染火鸡、鸽子、鸭子^[15]，M56型感染麝鼠，WC型主要感染牛^[14]。

衣原体的检测方法包括病原学检测、血清学检测和分子生物学检测。鉴于C. psittaci的传染性，通过细胞培养直接鉴定C. psittaci存在生物安全风险，需在生物安全3级实验室进行^[16]。考虑到衣原体体外培养难度较大，从2018年开始，世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health，WOAH）不再推荐衣原体分离作为首选的检测方法^[17]。而免疫荧光、补体结合试验等血清学检测技术存在检测周期长、特异性不足或灵敏性不足的缺点^[2]。随着检测技术的发展，在保证特异性灵敏性的情况下，科研人员对检测速度的要求进一步提高，分子生物学检测技术由于更适合于实验室确诊、现场检测及流行病学调查而从中脱颖而出。

2 分子检测技术进展

我国现行的动物鹦鹉热衣原体检测标准包括SN/T 2846—2011和NY/T 562—2015。两个标准都提及分子检测方法，包括聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）、实时定量聚合酶链式反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）、聚合酶链式反应结合限制性片段长度多态分析（Polymerase chain reaction-restrition fragment length polymophism，PCR-RFLP）和巢式聚合酶链式反应（Nested polymerase chain reaction，Nested PCR），这些均为成熟的检测方法。随着新型分子生物学检测技术的发展，研究人员基于等温扩增、数字PCR、高通量测序等技术开发了新检测方法，为C. psittaci的快速准确鉴定提供新思路。

2.1 基于聚合酶链式反应技术的C. psittaci检测

PCR是目前最为成熟的核酸扩增技术。在传染病诊断方法中，PCR技术与分离培养、血清学检测方法相比，具有快速、灵敏、准确、经济的特点，已成为病原核酸检测的常用方法。Alejandra Ruiz-Laiton等^[18]于2022年报道，使用PCR扩增方法对哥伦比亚的一批鹦鹉科动物进行C. psittaci筛查，从177只鹦鹉采集泄殖腔拭子166份和粪便样本177份。ompA基因扩增结果显示，177只鹦鹉中81.3%检出A型C. psittaci，其中泄殖腔拭子阳性率为77.7%、粪便样本阳性率为29.9%。与采用间接ELISA方法进行血清学监测（阳性率为85%）结果基本一致。根据已发表的文献数据，基于PCR的C. psittaci检测技术，扩增靶标基因主要为ompA、MOMP、16S rRNA、23S rRNA，扩增产物测序后经比对分析，可对衣原体的亚型进行准确分型。

巢式PCR（Nested PCR）是一种由PCR衍生出的核酸扩增方法，使用内外2对PCR引物进行两轮PCR反应来扩增目的片段。第一轮PCR反应使用外引物，第二轮PCR反应使用内引物扩增第一轮PCR产物。通过2次扩增能显著提高PCR扩增的特异性和灵敏度。S A Madani等^[19]使用巢式PCR方法对253份禽类临床样本进行检测，C. psittaci阳性率为12.6%。该研究中使用的巢式PCR检测方法在其他若干研究中也曾使用并取得较好效果。不过该引物组合是基于旧的分类标准（仅将衣原体分为4种），而按照现行衣原体分类，该巢式PCR并不能鉴别C. psittaci和C. abortus。同时该学者通过巢式PCR筛选出的阳性样本还采用了PCR-RFLP方法及ompA基因DNA测序方法进行分型。但在巢式PCR检测阳性的32个样本中，仅17个样品使用PCR-RFLP方法扩增出长片段。经酶切后仅12个可进行最终分析。2种方法检出率不一致的原因可能是巢式PCR扩增产物片段较PCR-RFLP方法短，更易于扩增；且巢式PCR经过两轮PCR扩增，扩增效率显著提高。这提示巢式PCR具有更高的灵敏度。Nadia Golestani等^[20]采用巢式PCR扩增ompA基因并进行测序（所用引物与S A Madani等报道的文献中一致），对随机采集的伊朗德黑兰30个鸽舍的鸽子咽拭子样品进行检测，结果显示C. psittaci阳性率为50%。目前国内现行的动物衣原体检测标准NY/T 562—2015中也包括巢式PCR方法，提示巢式PCR用于衣原体检测，其灵敏度高、经济；缺点在于检测耗时较长，两轮PCR的扩增程序耗时约6 h，且第二轮PCR扩增以第一轮PCR反应产物为模板，需开启PCR管，这一操作增加了气溶胶污染风险。因此，这种检测方法更适合回顾分析或时效性要求低的检测任务。

2.2 基于实时定量PCR的C. psittaci检测

实时定量PCR（qPCR）是目前常用且成熟的分子检测技术，该方法是一种以PCR为基础，通过仪器检测荧光染料或荧光探针在核酸扩增过程中实时产生的荧光信号，进而对核酸进行定量分析的核酸检测技术。随着检测技术的进步及更多种类的衣原体被陆续发现，单重实时定量PCR检测C. psittaci的方法已经不能满足当下快速检测的需求。近年来，许多学者开始探索多重实时定量技术。Onya Opota等^[21]建立双重qPCR方法，用于鉴别临床样本中的C. psittaci和C. abortus。该方法包含2对引物，第一对引物靶向16S-23S rRNA 操纵子序列，可以同时检出C. psittaci和C. abortus；第二对引物靶向C. psittaci特有的DNA序列CPSIT 0607。该方法具有低成本和省时的特点，有望提高大规模筛查时的检测效率；然而某些C. psittaci菌株可能不含CPSIT 0607 序列，因此如需确诊C. psittaci还应联合使用其他检测方法。2017年，该学者又建立了C. psittaci、C. abortus、肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae，C. pneumoniae）的qPCR诊断方法^[22]，通过3对引物探针组合达到鉴别目的（3对组合分别靶向pst1、16S-23S操纵子、序列CPSIT 0607：组合1可检出C. pneumoniae、组合2可检出C. psittaci和C. abortus、组合3可检出C. psittaci）。Nie F等^[23]基于TaqMan-MGB技术建立了三重qPCR检测方法，该方法能同时鉴别C. abortus、C. suis和C. psittaci，对C. psittaci的检测限为16拷贝/μL，灵敏度和特异性也略优于WOAH建议的衣原体巢式PCR检测方法。Lee O M等^[24]建立的多重qPCR检测方法，能够通过23S rRNA识别禽类衣原体属并能区别C. psittaci、禽衣原体（C. avium）和鸡衣原体（C. gallinacea）。Øystein Angen等^[25]根据大量序列对比分析，发现了未知功能区一段内含子序列可区别C. psittaci和C. abortus、沙眼衣原体，据此建立了qPCR检测方法。Kyoko Hisada等^[26]2021年报道了一种基于新型猝灭探针PCR方法的快速检测方法，可鉴别C. pneumoniae和C. psittaci。这一方法与常规qPCR灵敏度一致，但其借助新型全自动基因分析仪（GENECUBE）将检测时间缩短至50 min，比常规qPCR快1～2 h，可在临床实验室中进行快速鉴别检测。

2.3 基于多位点序列分型技术的C. psittaci检测

多位点序列分型（Multi Locus Sequence Typing，MLST）是一种基于核酸测序的分子生物学诊断方法。该方法通过PCR扩增多个管家基因片段并测序，分析序列差异从而达到诊断不同病原目的。随着多位点测序技术的发展，多位学者揭示了C. psittaci与其他衣原体在基因片段和易感宿主等方面的差异，使C. psittaci分子检测的准确性得到保障，为快速识别C. psittaci作出贡献。Yvonne Pannekoek等^[27]人曾使用MLST方法对132个C. psittaci样本进行分析，揭示了C. psittaci基因型和宿主物种之间的联系，WOAH诊断试验手册（2018版）中也将该方法作为C. psittaci鉴定及分型的参考方法之一。Prisca Mattmann等^[28]曾使用该技术对瑞士不同地区的431只鸽子进行检测。2021年Fabien Vorimore等^[29]人建立类似的鹦鹉热诊断方法，利用PCR结合高分辨溶解曲线（high-resolution melting，HRM）的方法，基于单核苷酸多态性对C. psittaci进行基因分型，结果与MLST方法相似。

2.4 基于DNA微阵列芯片技术的C. psittaci检测

DNA 微阵列（DNA microarray）即基因芯片（Gene chip）。其原理是在载体（尼龙膜、硅片等）表面合成成千上万个寡核苷酸探针，再与放射性同位素或荧光物标记的DNA或cDNA 模板杂交，通过仪器设备识别每个探针的信号从而获得样品 DNA 序列，可实现定量与定性分析。早在2008年，Sachse K等^[30]就使用DNA微阵列技术，对ompA基因35个不同的靶标平行检测，能够识别微小的核苷酸序列变异，从而区分不同基因型的C. psittaci。该方法能够充分反映ompA序列的种内异质性。这一方法的建立不仅能够识别新类型的菌株，而且无需完整ompA基因测序就可对C. psittaci进行基因分型，能够降低诊断成本。次年，该学者又将DNA微阵列方法进行改进^[31]，提高了检测速度和检测能力，可在一个工作日内鉴别不同的衣原体并进行C. psittaci分型，这为C. psittaci分型标准的完善提供了参考。

2.5 基于液滴式数字PCR技术的C. psittaci检测

液滴式数字PCR（droplet digital PCR，dd PCR）系统是利用微滴发生器将含有核酸分子的反应体系分配到数百万个pL级别的油包水微滴中，使每个反应单元中只有单个模板分子，再进行PCR扩增反应。相比qPCR，dd PCR灵敏度更高，且重复性更好。不仅如此，dd PCR对低拷贝数的DNA模板有良好的扩增效果，结果也更加精确、可信。Sahu R等^[32]建立的dd PCR检测方法，靶向CPSIT RS 01985基因，该方法灵敏、稳定、特异，检测限可达2.4拷贝/反应，适用于衣原体含量较低的样本。

2.6 基于环介导等温扩增技术的C. psittaci检测

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）利用Bst DNA聚合酶和4条特异引物，在等温条件下扩增目标核酸片段。该技术在恒温条件下即可进行，扩增时间短（30～60 min）、灵敏度高，在反应液中加入荧光染料或指示剂可实现结果读取可视化，是一种有前景的快速核酸扩增技术。Martina Jelocnik等^[33]根据特异性保守区域Cps 0607基因片段建立的LAMP方法，特异、重复性较好，灵敏度可以达10拷贝/反应，平均反应时间为14 min，与qPCR法的阳性检出符合率为92.3%。此外，该学者还尝试了新的快速拭子处理办法，无需提取DNA，使用马胎盘拭子匀浆上清液直接进行LAMP扩增，平均用时不超过20 min。该成果为马感染C. psittaci的现场检测提供了更加方便的方法，但该方法所需反应温度较高（84.5℃），不适用于条件简陋的检测现场。

2.7 基于RPA技术的C. psittaci检测

RPA（recombinase polymerase amplification，RPA）是一种新型等温核酸快速扩增技术，依靠重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶，在室温（37～42℃）下即可进行体外核酸扩增，扩增速度快（10～12 min）。目前的RPA技术根据结果读取方式可分为三类，包括基础型、荧光型以及横向流动试纸条型（lateral flow device，LFD）。

目前已报道一种荧光型RPA检测方法^[34]和一种RPA-LFD检测方法^[35]。荧光型RPA相比qPCR，能在更短的时间内达到相应的荧光信号。Y Pang等^[34]针对ompA建立的荧光RPA检测方法，该方法能在20 min完成核酸扩增，灵敏度为100拷贝/反应，特异性良好。试纸条是RPA技术的另一种结果读取方式，基于RPA-LFD技术可以仅靠人体热量完成反应并借助试纸条进行可视化结果判读^[36]，即使非专业人士也能直接观察并分析结果，非常适合条件艰苦、设备匮乏地区的现场检测^[37]。Jiao J等^[35]针对CPSIT RS0 2830基因建立的RAA-LFD检测方法在39℃条件下15 min内完成反应，检出限为1 拷贝/μL，且特异性好。应用该方法检测人工感染C. psittaci的小鼠粪便样品，可在感染1 d后测出阳性结果。然而，试纸条在显色过程中，反应管盖子必须保持打开，这一操作使RPA反应体系与环境接触，极易造成气溶胶污染并影响其他样品检测结果，存在一定缺陷。

2.8 宏基因组下一代测序技术在C. psittaci检测中的进展

宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是一种基于核酸测序的分子诊断方法。该技术经过核酸提取、文库构建和高通量测序，得到病原基因组序列，与已知的病原微生物数据库比对分析后，即可获得样品中病原微生物的定性和定量结果^[38]。2020年Chen X等^[39]首次报道使用该技术从支气管肺泡灌洗液和脑脊液中诊断出C. psittaci。该学者指出临床医生在遇到非典型肺炎患者伴有脑膜炎症状时，使用mNGS辅助病原学诊断是一种有前途、值得推荐的检测方法。

相比培养检测方法，mNGS能够检出更多被金标准判定的阳性样品，而且能大幅缩短检测周期，但其检测费用是常规培养方法的十倍或更多，不适用于现阶段大规模检测。mNGS与其他检测技术相比优点明显，mNGS无需耗费大量时间分离病原，也无需担心抗原检测的低灵敏度。其广泛的检测范围使其无须确定疑似病原体就可进行病原筛查，因此大幅度提高诊断的效率。但该技术同样有一些局限性：1）建立病原微生物基因库的机构需要不断完善现有基因库并及时更新；2）现阶段使用该技术诊断成本较高，不适用于大规模的动物疫病监测。如果未来能降低该技术成本，mNGS依然是有前景的诊断技术。

3 展望

鹦鹉热作为一种具有传染性的人兽共患病，不仅影响动物的生存和繁殖，还会威胁人类的健康和生命安全，其潜伏感染和强传播力使得医护人员对该病原的诊断和防治困难重重。有研究表明鸦科和鹰正在成为衣原体在野生动物中的重要宿主，因此相关工作人员应加强野生动物C. psittaci的监测。

目前的分子检测技术大多都需要较为苛刻的实验室环境和专业的检测人员。在条件艰苦或卫生条件较差的地区，传染病更容易传播。因此，发展更加方便、灵敏且快速的现场检测方法是未来研究的方向。等温扩增分子检测技术近年来愈发成熟，逐渐被重视并开始应用于人畜共患病病原体的检测。RPA接近人体温的反应温度和较短的反应时间（5～20 min）的特点使其更加适合应用于现场快速检测。近几年也不断有学者尝试将RPA与LFD、CRISPR/Cas系统以及其他诊断技术进行结合，用来开发更加灵敏便捷的分子诊断方法^[40]。也有学者使用另一多酶等温扩增技术，该技术采用名为Streptomyces azure recA（SC-recA）的重组酶，以提高反应稳定性和抗干扰能力^[41]。此外，还有学者开发了可重复使用的双通道光纤免疫传感器（dual-channel optic fiber immunosensor，DOFIS），可在10 min完成检测，且成本低、操作简单^[42]。上述快速检测方法均可为C. psittaci快速检测的发展提供一定参考。

参考文献

[1] Kowalczyk K, Wójcik-Fatla A. Chlamydia psittaci in Faecal Samples of Feral Pigeons (Columba livia forma urbana) in Urban Areas of Lublin city, Poland[J]. Current Microbiology, 2022, 79(12): 1-8.

[2] Muroni G, Pinna L, Serra E, et al. A Chlamydia psittaci Outbreak in Psittacine Birds in Sardinia, Italy[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2022, 19(21): 14204.

[3] Stokes H S, Martens J M, Walder K, et al. Species, sex and geographic variation in chlamydial prevalence in abundant wild Australian parrots[J]. Scientific Reports, 2020, 10(1): 20478. DOI: 10.1038/s41598-020-77500-5.

[4] Sutherland M, Sarker S, Vaz P K, et al. Disease surveillance in wild Victorian cacatuids reveals co-infection with multiple agents and detection of novel avian viruses[J]. Veterinary Microbiology, 2019, 235: 257-264.

[5] Cong W, Huang S Y, Zhang X X, et al. Chlamydia psittaci exposure in pet birds[J]. Journal of Medical Microbiology, 2014, 63(4): 578. DOI: 10.1099/jmm.0.070003-0.

[6] Cong W, Huang S Y, Zhang X Y, et al. Seroprevalence of Chlamydia psittaci infection in market-sold adult chickens, ducks and pigeons in north-western China[J]. Journal of Medical Microbiology, 2013, 62(8): 1211. DOI: 10.1099/jmm.0.059287-0.

[7] Yin Q, Li Y, Pan H, et al. Atypical pneumonia caused by Chlamydia psittaci during the COVID-19 pandemic[J]. International Journal of Infectious Diseases, 2022, 122: 622-627.

[8] Balsamo G, Maxted A M, Midla J W, et al. Compendium of Measures to Control Chlamydia psittaci Infection Among Humans (Psittacosis) and Pet Birds (Avian Chlamydiosis)[J]. Journal of Avian Medicine and surgery, 2017, 31(3): 262-282.

[9] Xiao Q, Shen W, Zou Y, et al. Sixteen cases of severe pneumonia caused by Chlamydia psittaci in South China investigated via metagenomic next-generation sequencing[J]. Journal of Medical Microbiology, 2021, 70(11). DOI: 10.1099/jmm.0.001456.

[10] Chen X, Cao K, Wei Y, et al. Metagenomic next-generation sequencing in the diagnosis of severe pneumonias caused by Chlamydia psittaci[J]. Infection, 2020, 48(4): 535-542.

[11] Li N, Li S, Tan W, et al. Metagenomic next-generation sequencing in the family outbreak of psittacosis: the first reported family outbreak of psittacosis in China under COVID-19[J]. Emerging Microbes & Infections, 2021, 10(1): 1418-1428.

[12] Zhang Z, Zhou H, Cao H, et al. Human-to-human transmission of Chlamydia psittaci in China, 2020: an epidemiological and aetiological investigation[J]. The Lancet. Microbe, 2022, 3(7): e512-e520.

[13] Zaręba-Marchewka K, Szymańska-Czerwińska M, Niemczuk K. Chlamydiae-What’s New[J]. Journal of Veterinary Research, 2020, 64(4): 461-467.

[14] Stokes H S, Berg M L, Bennett A T D. A Review of Chlamydial Infections in Wild Birds[J]. Pathogens (Basel), 2021, 10(8): 948. DOI: 10.3390/pathogens10080948.

[15] Ravichandran K, Anbazhagan S, Karthik K, et al. A comprehensive review on avian chlamydiosis: a neglected zoonotic disease[J]. Tropical Animal Health and Production, 2021, 53(4): 414. DOI: 10.1007/s11250-021-02859-0.

[16] Ménard A, Clerc M, Subtil A, et al. Development of a real-time PCR for the detection of Chlamydia psittaci[J]. Journal of Medical Microbiology, 2006, 55(4):471. DOI: 10.1099/jmm.0.46335-0.

[17] Sahu R, Vishnuraj M R, Srinivas C, et al. Development and comparative evaluation of droplet digital PCR and quantitative PCR for the detection and quantification of Chlamydia psittaci[J]. Journal of Microbiological Methods, 2021, 190: 106318. DOI: 10.1016/j.mimet.2021.106318.

[18] Ruiz-Laiton A, Molano-Ayala N, García-Castiblanco S, et al. The prevalence of Chlamydia psittaci in confiscated Psittacidae in Colombia[J]. Preventive Veterinary Medicine, 2022, 200. DOI: 10.1016/j.prevetmed.2022.105591.

[19] Madani S A, Peighambari S M. PCR-based diagnosis, molecular characterization and detection of atypical strains of avian Chlamydia psittaci in companion and wild birds[J]. Avian Pathology, 2013, 42(1): 38-44.

[20] Golestani N, Khoshkhoo P H, Hosseini H, et al. Detection and identification of Chlamydia spp. from pigeons in Iran by nested PCR and sequencing[J]. Iranian Journal of Microbiology, 2020, 12(4): 331-337.

[21] Opota O, Jaton K, Branley J, et al. Improving the molecular diagnosis of Chlamydia psittaci and Chlamydia abortus infection with a species-specific duplex real-time PCR[J]. Journal of Medical Microbiology, 2015, 64(10): 1174. DOI: 10.1099/jmm.0.000139.

[22] Opota O, Brouillet R, Greub G, et al. Methods for Real-Time PCR-Based Diagnosis of Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, and Chlamydia abortus Infections in an Opened Molecular Diagnostic Platform[J]. Methods in Molecular Biology, 2017, 1616: 171-181.

[23] Nie F, Gong Q, Yang J, et al. Establishment of a Multiplex Real-Time TaqMan-MGB Polymerase Chain Reaction (PCR) Method for the Simultaneous Detection of Three Animal Chlamydia Species[J]. Medical Science Monitor, 2019, 25: 9369-9376.

[24] Lee O M, Lee H, Kang S, et al. A multiplex real-time PCR assay for differential identification of avian Chlamydia[J]. Avian Pathology, 2022, 51(2): 164-170.

[25] Angen Ø, Johannesen T B, Petersen R F, et al. Development of a species-specific real-time PCR test for Chlamydia psittaci and its employment in the investigation of zoonotic transmission from racing pigeons in Denmark[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2021, 100(2): 115341. DOI: 10.1016/j.diagmicrobio.2021.115341.

[26] Hisada K, Hida Y, Kawabata N, et al. Development and evaluation of a novel quenching probe PCR (GENECUBE) assay for rapidly detecting and distinguishing between Chlamydia pneumoniae and Chlamydia psittaci[J]. Journal of Microbiological Methods, 2021, 184:106212. DOI: 10.1016/j.mimet.2021.106212.

[27] Pannekoek Y, Dickx V, Beeckman D S A, et al. Multi locus sequence typing of Chlamydia reveals an association between Chlamydia psittaci genotypes and host species[J]. PloS One, 2010, 5(12): e14179. DOI: 10.1371/journal.pone.0014179.

[28] Mattmann P, Marti H, Borel N, et al. Chlamydiaceae in wild, feral and domestic pigeons in Switzerland and insight into population dynamics by Chlamydia psittaci multilocus sequence typing[J]. 2019, 14(12): e226088. DOI: 10.1371/journal.pone.0226088.

[29] Vorimore F, Aaziz R, de Barbeyrac B, et al. A New SNP-Based Genotyping Method for C. psittaci: Application to Field Samples for Quick Identification[J]. Microorganisms (Basel), 2021, 9(3): 625. DOI: 10.3390/microorganisms9030625.

[30] Sachse K, Laroucau K, Hotzel H, et al. Genotyping of Chlamydophila psittaci using a new DNA microarray assay based on sequence analysis of ompA genes[J]. BMC Microbiology, 2008, 8(1): 63. DOI: 10.1186/1471-2180-8-63.

[31] Sachse K, Laroucau K, Vorimore F, et al. DNA microarray-based genotyping of Chlamydophila psittaci strains from culture and clinical samples[J]. Veterinary Microbiology, 2009, 135(1-2): 22-30.

[32] Sahu R, Vishnuraj M R, Srinivas C, et al. Development and comparative evaluation of droplet digital PCR and quantitative PCR for the detection and quantification of Chlamydia psittaci[J]. Journal of Microbiological Methods, 2021, 190: 106318. DOI: 10.1016/j.mimet.2021.106318.

[33] Jelocnik M, Islam M M, Madden D, et al. Development and evaluation of rapid novel isothermal amplification assays for important veterinary pathogens: Chlamydia psittaci and Chlamydia pecorum[J]. PeerJ (San Francisco, CA), 2017, 5: e3799. DOI: 10.7717/peerj.3799.

[34] Pang Y, Cong F, Zhang X, et al. A recombinase polymerase amplification–based assay for rapid detection of Chlamydia psittaci[J]. Poultry Science, 2021, 100(2): 585-591.

[35] Jiao J, Qi Y, He P, et al. Development of a Lateral Flow Strip-Based Recombinase-Aided Amplification for Active Chlamydia psittaci Infection[J]. Frontiers in Microbiology, 2022, 13: 928025. DOI: 10.3389/fmicb.2022.928025.

[36] Gumaa M M, Cao X, Li Z, et al. Establishment of a recombinase polymerase amplification (RPA) assay for the detection of Brucella spp. Infection[J]. Molecular and Cellular Probes, 2019, 47: 101434. DOI: 10.1186/s12917-022-03465-4.

[37] Shelite T R, Bopp N E, Moncayo A, et al. Isothermal Recombinase Polymerase Amplification-Lateral Flow Point-of-Care Diagnostic Test for Heartland Virus[J]. Vector Borne and Zoonotic Diseases (Larchmont, N.Y.), 2021, 21(2): 11-15.

[38] Li H, Hao B, Wang Y, et al. Metagenomic next‐generation sequencing for the diagnosis of Chlamydia psittaci pneumonia[J]. The Clinical Respiratory Journal, 2022, 16(7): 513-521.

[39] Chen X, Cao K, Wei Y, et al. Metagenomic next-generation sequencing in the diagnosis of severe pneumonias caused by Chlamydia psittaci[J]. Infection, 2020, 48(4): 535-542.

[40] Selvam K, Ahmad Najib M, Khalid M F, et al. CRISPR-Cas Systems-Based Bacterial Detection: A Scoping Review[J]. Diagnostics (Basel), 2022, 12(6): 1335. DOI: 10.3390/diagnostics12061335.

[41] Heng P, Liu J, Song Z, et al. Rapid detection of Staphylococcus aureus using a novel multienzyme isothermal rapid amplification technique[J]. Frontiers in Microbiology, 2022, 13: 1027785. DOI: 10.3389/fmicb.2022.1027785.[42] Yang Y, Zhao R, Wang Y, et al. Rapid and universal detection of SARS-CoV-2 and influenza A virus using a reusable dual-channel optic fiber immunosensor[J]. Journal of Medical Virology, 2022, 94(11): 5325-5335.

基金项目：重庆市技术创新与应用发展专项（CSTB2022TIAD-GPX0058）

第一作者：苏博（1996—），男，汉族，硕士，主要从事动物病毒分子生物研究，E-mail: 340292838@qq.com

通信作者：聂福平（1980—），女，汉族，博士，正高级兽医师，主要从事动物检疫及传染病研究，E-mail: nie1626@163.com

1. 重庆海关技术中心国家牛病检测重点实验室重庆 400020

2. 中国海关科学技术研究中心北京 100026

3. 重庆市森林病虫防治检疫站重庆 401120

1. Chongqing Customs Technology Center, State Key Laboratory of Bovine Diseases, Chongqing 400020

2. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

3. Forest Disease and Pest Control and Quarantine Station of Chongqing, Chongqing 401120