魏欣欣 刘宝如 郄俊青 张海超 张婧雯 黄雪静 贾海涛 王敬

Abstract A method was developed for the determination of clenproperol residues in animal-derived foods by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The samples were extracted by ammonium acetate solution, purified by MCX (mixed-mode cationic exchange) solid phase extraction column, eluted on a C₁₈ column with 0.1% formic acid aqueous solution and methanol as the mobile phase, analyzed in multi-reaction monitoring (MRM) positive ion scanning mode, and quantified by internal standard method. The method showed good linearity in the range of 0.1-50 ng/mL with correlation coefficient greater than 0.999. The limit of detection (LOD) was 0.2 μg/kg, and the limit of quantitation (LOQ) was 0.5 μg/kg. At the three spiked levels of 0.5 μg/kg, 1 μg/kg and 5 μg/kg, the recoveries in different matrices were in the range of 80.2%-108.6%, with relative standard deviations (RSDs) of 3.02%-10.3%. This method has good selectivity and strong anti-interference ability, which can meet the requirements of domestic and foreign regulations, and provide technical support for the monitoring of clenproperol residues in animal-derived foods.

Keywords liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); solid-phase extraction; clenproperol; animal-derived foods

β-受体激动剂（俗称“瘦肉精”），是一类具有促肾上腺素功能的人工合成化合物，在医学上主要用于治疗支气管哮喘、阻塞性肺炎等病症^[1-2]。β-受体激动剂类药物因其能够增加运动爆发力的作用被世界反兴奋剂机构明确列为禁用药物，同时也是引起运动员兴奋剂误食事件最严重的一类化合物。如肉类制品曾多次爆出“瘦肉精”事件，使用“瘦肉精”会导致克伦特罗残留于动物肌肉、内脏和脂肪组织当中^[3-4]。由于国家和地方政府对传统瘦肉精的监控更加严格，使得动物源性食品中残留克伦丙罗等新型瘦肉精使用情况更加突出。克仑丙罗，又称克仑普罗，分子式为C₁₁H₁₆Cl₂N₂O，属于β-受体激动剂类药物。2021年11月国家体育总局反兴奋剂中心发布的《大型赛事食源性兴奋剂防控工作指南》明确将克伦丙罗列入必检项目。另外，在《冬奥会食品安全食品动物食源性兴奋剂类药品控制管理规范》中将克伦丙罗列入《饲养过程中禁止使用的食源性兴奋剂类药品目录》。因此，加强对动物源性食品中克伦丙罗残留的检测工作十分重要，需要尽快建立一种快速、准确的测定动物源性食品中克伦丙罗残留的方法。

现有克伦丙罗的检测方法检测基质为饲料和血液制品，如农业部1629号公告-1-2011^[5]、农业部1063号公告-6-2008^[6]、NY/T 3145-2017^[7]和NY/T 3144-2017^[8]。目前关于动物源性食品中克伦丙罗的检测基质仅局限于牛羊肉、牛奶和鸡蛋等^[9-11]，基质类型覆盖面较窄，对于调制肉制品基质并未涉及。其次文献方法多采用外标法定量，但动物源性食品含有较多的蛋白、脂肪和磷脂，出现阳性样品时采用外标法定量易出现偏差。此外，文献方法与其他β-受体激动剂同时测定，均经过了较长时间酶解使药物游离出来再进行提取，耗时较长^[12-14]。本研究采用固相萃取作为前处理技术，建立了测定肌肉组织（牛肉、羊肉、猪肉）、调制肉（咖喱肉、火腿、牛肉饼、羊肉串、猪肉丸）、肝脏组织（猪肝、猪肾、牛肝、牛肾、羊肝、羊肾）、猪脂肪、牛奶和鸡蛋等基质动物源性食品中克伦丙罗残留量的高效液相色谱-串联质谱法，为打击在动物源性食品中该类药物的违法使用提供强有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

克伦丙罗（纯度≥97%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；克伦丙罗-D₇（100 μg/mL，曼哈格检测技术有限公司）；正己烷、甲醇、甲酸为色谱纯（美国Sigma公司）；氨水、乙酸铵、冰醋酸为分析纯（上海国药集团化学试剂公司）；Oasis MCX阳离子固相萃取柱（60 mg，3 mL，美国Waters公司）；实验室用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

Waters Acquity UPLC/XEVO^TM TQ-S液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源，美国Waters公司）；TurboVapLV型氮吹浓缩仪（美国Zymark公司）；PT3100型均质器（瑞士Kinematica公司）；固相萃取柱装置（美国Waters公司）；Milli-Q纯化系统（Millipore公司）；CR22GⅢ型高速冷冻离心机（日本HITACHI公司）；ML 204/02分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

准确称取2 g试样（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入50 μL克仑丙罗-D₇内标工作溶液，加入20 mL乙酸铵缓冲溶液，以11000 r/min均质提取1 min，10000 r/min离心5 min，收集上清液至50 mL具塞离心管中，加入20 mL正己烷涡旋混匀2 min。10000 r/min离心5 min，弃去正己烷层，水相溶液经滤纸过滤，并用2 mL乙酸铵缓冲溶液洗涤滤纸，收集全部滤液，待净化。

将MCX柱置于固相萃取架上，依次用3 mL甲醇和3 mL水对柱子进行活化，将上述所得滤液全部过柱，再依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽干2 min。用氨水甲醇洗脱溶液3 mL洗脱，于40℃氮气吹干。残余物用0.1%甲酸水-甲醇（9∶1，v/v）1 mL溶解残渣，涡旋混匀，过0.22 μm微孔滤膜后供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

1.3.2 仪器条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；进样量：5 μL；流动相：A为0.1%的甲酸水溶液，B为甲醇；流速为400 μL/min；梯度洗脱为：0～1.0 min，10% B；1.0～3.5 min，10%～30% B；3.5～5.0 min，30%～90% B；5.0～6.5 min，90% B；6.5～6.51 min，90 %～10% B；6.51～8.0 min，10% B。

电离方式：电喷雾电离正离子模式ESI+；检测模式：多反应监测（MRM）；正离子模式电喷雾电压：2.5 kV；离子源温度：150℃；雾化气温度：500℃；雾化气流速：1000 L/h；锥孔反吹气流速：150 L/h；雾化气压力：7 Bar；源内诱导解离电压：50 V；碰撞气：高纯氩气；碰撞气流速：0.17 mL/min；克伦丙罗定量离子对（263.2，245.1）（碰撞能量：15 V），定性离子对（263.2，202.9）（碰撞能量：25 V）；克伦丙罗-D₇离子对（270.3，252.2）（碰撞能量：15 V）。

2 结果与讨论

2.1 提取溶液的优化

根据β-受体激动剂苯环上取代基的不同，可分为苯酚型和苯胺型。克伦丙罗属于苯胺型结构，轭合反应率和蛋白结合率低，可直接进行提取^[15-16]。克伦丙罗为碱性化合物，pKa＞7，在酸性条件下带正电。试验以阴性猪肉、猪肝样品为例，调节样品溶液至固定pH值，使待测物质离子化的同时使得蛋白杂质变性，再离心去除固体杂质，同时加入正己烷液液萃取，能够去除脂溶性杂质，然后再采用固相萃取法净化。

2.2 固相萃取柱的选择

试验比较了C₁₈、HLB、MCX和WCX固相萃取柱，结果表明，C₁₈、HLB和WCX对目标物的保留较弱。而MCX将磺酸基团键合在高度交联的PS/DVB的表面得到混合型阳离子吸附剂，有反相和强阳离子交换双重保留性能，对碱性物质有良好的灵敏度和选择性。试验同时考察了不同pH条件下，MCX对克伦丙罗（10 ng/mL）的回收率效果，结果如图1所示。当pH为5.2时，回收率最好。由于MCX柱是利用阳离子交换作用保留克伦丙罗，水和甲醇不能将其洗脱，但能达到洗脱极性和非极性杂质，所以选择甲醇和水作为淋洗液。氨水甲醇是阳离子固相萃取柱常用的洗脱剂，且洗脱液洗脱杂质较少易吹干，可保证克伦丙罗完全被洗脱下来，试验采用的5%氨水甲醇进行洗脱。

图1 不同pH条件下克伦丙罗的回收率

Fig.1 Recovery rates of clenproperol under different pH conditions

试验发现，洗脱液在第1 mL时克伦丙罗可保证洗脱比例在90%以上，试验用50 ng/mL不同基质标准溶液过固相萃取柱，萃取液上样体积为20 mL，选用甲醇作为洗脱剂，加入不同体积氨水（0、1%、2%、5%、8%和10%）调节洗脱强度，在洗脱剂体积不变的条件下，随着氨水浓度的增加，回收率逐渐升高，当氨水浓度超过5%后，洗脱下来的杂质相应增加，因此选用5%氨水甲醇作为洗脱剂。为了达到更好的净化效果和更高的洗脱比例，试验对洗脱体积采用分段收集的方式进行了考察，分别用1 mL、2 mL、3 mL、5 mL和8 mL混合液进行洗脱并收集，如图2所示。结果发现，回收率随着洗脱剂的体积增加而增加，当氨水甲醇洗脱液为2 mL时，克伦丙罗洗脱不完全，回收率为90%左右，当体积达到3 mL后，目标物基本能够完全洗脱，继续增加洗脱液对回收率的影响不大，但质谱背景明显增高，因此选用3 mL 5%氨水甲醇进行洗脱。

图2 洗脱体积对克伦丙罗回收率的影响

Fig.2 The influence of elution volume on the recovery rate of clenproperol

2.3 色谱条件的优化

实验选择了Aglient ZORBAX SB C₁₈柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）和Waters ACQUITY BEH C₁₈柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）进行分离，发现Waters ACQUITY BEH C₁₈柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分析克伦丙罗的保留能力强，灵敏度更高且色谱峰形最优，能够满足试验要求。实验比较了水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈和0.1%甲酸水溶液-甲醇进行梯度洗脱，发现没有甲酸存在时，会出现电离效果较差、峰形对称性差、峰拖尾、灵敏度下降等情况。图3表明，乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相时灵敏度下降且干扰大，甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相后情况得到了改善，且峰形和灵敏度均能满足要求。因此，确定甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

乙腈-0.1%甲酸水为流动相 甲醇-0.1%甲酸水为流动相

图3 不同流动相条件下克伦丙罗的色谱图

Fig.3 MRM chromatograms of clenproperol in different mobile phases

2.4 基质效应

基质效应会影响方法的灵敏度和准确性，给测定带来误差。本研究以基质匹配校正曲线和标准曲线斜率的比值来考察2种化合物的基质效应。如果比值在85%～115%之间，一般认为不存在基质效应。图4表明，对于所选动物源性样品，除牛奶和猪脂肪对离子起到增强作用，其他均为基质抑制作用，且大部分基质的ME值均在40%以上，说明基质对克伦丙罗的抑制很严重，基质匹配校正曲线斜率为标准曲线斜率的9%～71%，说明存在明显的基质抑制作用。为消除基质效应的干扰，实验采用内标法进行准确定量。

2.5 方法的线性范围、检出限和定量限

在方法所确定的实验条件下，分别配制浓度为0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL 、50.0 ng/mL 7个标准系列，内标浓度5.0 ng/mL，采用液相色谱串联质谱仪测定，得到线性回归方程为y = 0.8156x + 0.0205，相关系数r为0.9991，结果表明克伦丙罗在0.1～50 ng/mL范围内线性关系良好。同时，通过空白基质考察检出限和定量限，按3倍信噪比（S/N = 3）和10倍信噪比（S/N = 10）计算方法的检出限和定量限，克伦丙罗的检出限和定量限分别为0.2和0.5 μg/kg，能够满足国内外法规对β-受体激动剂残留要求的执行限量。

2.6 方法的回收率和精密度

实验以不含克伦丙罗的猪肉、牛肉、羊肉、猪肝、猪肾、牛肝、牛肾、羊肝、羊肾、火腿、牛肉饼、羊肉串、猪肉丸、咖喱肉、猪脂肪、牛奶和鸡蛋为空白基质样品，选择3个添加水平做加标回收率试验，结果见表1。

由表1可知，每个水平重复做6平行，方法的回收率范围为80.2%～108.6%，精密度范围为3.02%～10.3%，满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》附录F的要求。

3 结论

实验建立了液相色谱-串联质谱法检测动物源性食品中的克伦丙罗的检测方法。样品采用乙酸铵缓冲溶液提取，混合阳离子交换固相萃取柱（MCX）净化，同时利用质谱的高灵敏度和高选择性，实现了对猪肉、牛肉、羊肉、猪肝、猪肾、牛肝、牛肾、羊肝、羊肾、火腿、牛肉饼、羊肉串、猪肉丸、咖喱肉、鸡蛋、猪脂肪和牛奶等动物源性食品中的克伦丙罗的定性定量分析。克伦丙罗在0.1～50 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数大于0.999；方法检出限为0.2 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg。该方法灵敏度高、准确度好、分析时间短，可用于动物源性食品中克伦丙罗的残留量的应急检测或日常兽药残留监测。

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图4 不同样品中克伦丙罗的基质效应

Fig.4 Matrix effect of clenproperol in different matrices

表1 克伦丙罗的平均回收率范围及精密度（n = 8）

Table 1 Average recovery ranges and RSDs (n = 8) of clenproperol

表1（续）

基金项目：国家市场监督管理总局科技计划项目（2020MK105），甘肃省市场监督管理局科技计划项目（SSCJG-SP-A202306）

第一作者：姚璇（2001—），女，汉族，甘肃天水人，本科，主要从事食品安全检测，E-mail: 1094795552@qq.com

通信作者：解迎双（1985—），女，汉族，甘肃兰州人，硕士，高级工程师，主要从事食品安全检测工作，E-mail: 173355905@qq.com

1. 西北师范大学 兰州 730010

2. 兰州海关技术中心 兰州 730010

3. 白银市市场监管局 白银 730900

1. Northwest Normal University, Lanzhou 730010

2. Lanzhou Customs Technology Center, Lanzhou 730010

3. Baiyin’s Market Regulator, Baiyin 730900