李婕 温华蔚 王仲敏 柴铭骏 杨菲 马兴 王全新 于尧

竹醋液是一种生产过程复杂、组成成分复杂的混合物质。生产竹醋液的竹资源种类、热解工艺及含水率的不同决定了竹醋液性质的不同，竹醋液的组成也会因其收集方法、热解温度、贮存条件等的不同而不断变化^[1]。竹醋液是竹炭制作过程中产生的热解馏分经过冷凝回收得到的青黄色或黄棕色液体，又名竹沥，具有独特的烟熏香气，是一种含多种成分的混合物，其中除了大部分水之外，主要含有有机酸、酚类、醛类、酮类、醇类、酯类等^[2]。研究发现竹醋液具有很强的抑菌和促进植物生长的作用，在医药、化工、农业、环保等领域有着非常广泛的用途^[3-4]。

随着竹炭以及竹醋液制品在日本等国研究和应用的深入，我国对于相关产品的生产和性质研究也逐步展开。中国是竹子资源大国，充分研究并应用竹子资源将带来巨大的经济和社会效益。本实验采用邻苯三酚自氧化法、DPPH分光光度法、FRAP分光光度法和邻二氮菲法分别对竹醋液的超氧阴离子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、铁氰化钾还原能力以及羟自由基的清除能力进行研究，以求更加全面地了解各项抗氧化指标情况，进而探讨竹醋液可能存在的抗氧化性质。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

竹醋液；邻苯三酚(天津市津科精细化工研究所)；1,1-二苯-2-苦基肼（DPPH）（美国Sigma公司，分析纯）；铁氰化钾（天津市津科精细化工研究所，分析纯）；三氯化铁（北京试剂厂，分析纯）；邻二氮菲（广州精细化工研究所，分析纯）；无水乙醇、三氯乙酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）。

DPPH溶液：准确称取4 mg的DPPH，用无水乙醇定容至100 mL，得0.1 mol/L DPPH溶液。

铁氰化钾溶液：准确称取0.500 g铁氰化钾，于棕色容量瓶中用蒸馏水定容至50 mL。

邻苯三酚溶液：准确称取0.378 g邻苯三酚，用10 mmol/L HCl溶液定容至100 mL棕色容量瓶中，稀释10倍后得3 mmol/L邻苯三酚溶液，现用现配。

0.1%三氯化铁溶液：准确称取0.50 g三氯乙酸，用蒸馏水定容至50 mL，稀释10倍后即得质量分数为0.1%三氯化铁溶液。

0.75 mmol/L 邻二氮菲-乙醇溶液：准确称取0.371 g邻二氮菲加无水乙醇定容至25 mL棕色容量瓶中，再量取1 mL邻二氮菲-乙醇溶液稀释100倍后可得。

0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液：称取0.0209 g FeSO₄·7H₂O加入蒸馏水定容至100 mL容量瓶中即得。

0.1% H₂O₂溶液：取166.7 μL 30%双氧水，加入蒸馏水定容至50 mL。

1.2 主要仪器

SP22100UV 型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；DK29821 型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 竹醋液处理方法

为了对竹醋原液抗氧化性进行检测，只对竹醋液进行稀释操作，取适量竹醋液，分别用蒸馏水稀释制作质量浓度为0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.2 mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL的竹醋液，供试验测量使用。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的测定方法

准确量取质量浓度为0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL的竹醋液于试管中，各加入0.1 mol/L DPPH溶液4 mL。空白组以1 mL蒸馏水代替竹醋液，颜色消除组以4 mL无水乙醇代替DPPH溶液。将上述混合液配置好后，室温避光反应30 min，立即于517 nm处^[5-7]测吸光度A_i。30 s测1次，取3次平均值。以抗坏血酸作为阳性对照，平行测定3次。

DPPH自由基清除率K按式（1）计算：

DPPH自由基清除率K(%)＝[1－(A_i－A_j)/A₀]×100% (1)

式（1）中，A₀为空白组即只含DPPH自氧化体系的吸光值；A_i为实验组即加入DPPH和竹醋液后的吸光值；A_j为不同浓度各A_i所对应的颜色消除组吸光值（以无水乙醇代替实验组中的DPPH溶液）。

1.3.3 超氧阴离子自由基清除能力的测定方法

为研究竹醋液对于超氧阴离子自由基的清除能力，采用邻苯三酚自氧化法^[6-9]。准确量取质量浓度为0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL的竹醋液各0.2 mL于试管中，每试管加入50 mmol/L pH为8.2的Tris-HCl缓冲液4.0 mL，用蒸馏水补充体积至5.8 mL。将上述溶液配置好，并混合均匀放入恒温25℃水浴锅中加热20 min，取出后立即加入25℃预热过的3 mmol/L邻苯三酚0.2 mL，摇匀后迅速倒入比色皿中，以10 mmol/L HCl作为空白对照，实验组颜色消除使用10 mmol/L HCl代替邻苯三酚。在420 nm波长处，每间隔30 s测试1次吸光值，共反应6 min，平行测定3次。

以吸光值（A）对反应时间（t）作线性关系图，线性回归后斜率即为碱性邻苯三酚自氧化反应速率（V_t），代入式（2），计算出竹醋液对超氧阴离子自由基的清除率（Y）。根据加入竹醋液不同的稀释浓度（C），由式（2）计算出C对应的Y，以Y对C作图。

Y (%)＝(1－V_t / V₀）×100% (2)

式（2）中，V_t代表加入竹醋液后碱性邻苯三酚自氧化反应速率；V₀代表不加入任何抗氧化剂的邻苯三酚自氧化反应速率。

1.3.4 铁氰化钾还原能力的测定

相关研究表明，抗氧化剂的抗氧化性能与其还原能力相关^[10-13]。分别准确量取质量浓度为0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL的竹醋液1 mL，加入2.0 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲液中，每试管中加入10 mg/mL铁氰化钾溶液2.0 mL，混合均匀，在50℃水浴锅中加热20 min。取出试管冷却，再加入2.0 mL 100 mg/mL的三氯乙酸溶液和1.0 mL 质量分数0.1%的三氯化铁溶液，摇匀并迅速在700 nm处测定吸光度值，实验组颜色消除以PBS缓冲液代替0.1%的三氯化铁溶液。以抗坏血酸为阳性对照，平行测定3次并取平均值，吸光度越高，表示还原能力越强。

1.3.5 羟自由基清除能力的测定

按照相关羟自由基清除能力测定研究^[14-16]，依次向试管中加入1 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲溶液、2 mL 0.2 mol/L的磷酸缓冲溶液（pH 7.4）、1 mL蒸馏水，进行充分地摇匀，再加入0.75 mmol/L FeSO₄溶液1 mL，后进行充分混合，再加入1 mL 0.1%的H₂O₂，混匀后水浴反应60 min温度设定为37℃，在邻二氮菲-Fe²⁺具有最大吸收峰的536 nm处测定吸光度A_F。用蒸馏水代替上述方法中H₂O₂测定吸光度A₀。

以准确量取质量浓度为0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL的竹醋液代替上述方法中的蒸馏水，测定吸光度A_x。以PBS缓冲液代替醋液为实验组颜色消除，测定吸光度为A_C。平行测试3次并取平均值。按照式（3）计算不同浓度竹醋液对羟自由基的清除率。

羟自由基清除率= (3)

式（3）中，A_X为实验组吸光值（含有竹醋液和自氧化体系的实验组）；A_C为实验组颜色消除（仅含有自氧化体系，除去竹醋液自身颜色的颜色消除组）；A_F为空白组；A₀为空白组颜色消除。

2 结果与分析

2.1 竹醋液DPPH自由基清除能力

根据DPPH自由基清除率计算公式^[17]，计算出各个稀释浓度下竹醋液对于DPPH自由基的清除率K，以竹醋液浓度为横坐标，清除率为纵坐标作图1。从图1可以看出，竹醋液具有较强的清除DPPH自由基能力，并且随着竹醋液浓度的增加，清除率有显著增加，分别为51.17%（0.1 mg/mL）、59.70%（0.15 mg/mL）、67.00%（0.2 mg/mL）72.40%（0.25 mg/mL）、81.70%（0.3 mg/mL）。因所制取的DPPH溶液呈深紫色，且在517 nm有最大吸收峰，当反应体系中有抗氧化剂存在时，其呈现出的紫色会有一定程度的消退，故研究对象的DPPH自由基清除能力与DPPH溶液褪色程度相关。

图1 不同浓度竹醋液对于DPPH自由基的清除率

Fig.1 Scavenging efficiency of different concentrations of bamboo vinegar on DPPH radical

2.2 竹醋液超氧阴离子自由基清除能力

邻苯三酚自氧化体系在碱性条件下产生的超氧阴离子自由基在420 nm有最大吸收峰^[18]，并且较为稳定。根据上述操作方法，在360 s内，每隔30 s测试1次吸光度值，以反应时间对吸光度作曲线，如图2所示。

图2 不同质量浓度竹醋液作用下邻苯三酚自氧化体系

吸光度值随时间变化情况

Fig.2 Changes in absorbance values of pyrogallol autooxidation system over time under the action of bamboo vinegar with different mass concentrations

可见，在向邻苯三酚自氧化体系中加入各个浓度的竹醋液后，其氧化速率均有显著的降低趋势，并且随着加入的竹醋液浓度的增加，其氧化速率减小。另外，随着竹醋液浓度的增加，其氧化速率下降的程度也随之增大。也就是说，在反应体系各个液体加入总量一定的前提下，加入的竹醋液量越多，氧化速度越缓，则竹醋液对超氧阴离子自由基的清除能力越强。

相反，在空白组实验中产生的超氧阴离子自由基浓度在前期先显示出持续较快的上升趋势，后期浓度逐渐趋于稳定，不再上升。而在实验进行的360 s时间里，有加入竹醋液的反应体系中超氧阴离子自由基浓度与空白组相比 ，均呈相对缓慢的线性增长趋势。

2.3 竹醋液铁氰化钾还原能力

根据铁氰化钾还原能力的具体实验方法，普鲁士蓝Fe₄[Fe(CN)₆]的生成量可利用700 nm处吸光值判定，吸光值越大，表明物质的抗氧化活性越强。以竹醋液浓度对吸光度值A₇₀₀作图。从图3可以看出，竹醋液同样具有一定的铁氰化钾还原能力，是较好的电子提供者，其还原铁氰化钾的能力能够随着浓度的增加而增强，且基本呈线性增长的趋势。

图3 不同浓度竹醋液对铁氰化钾还原能力

Fig.3 The reducing ability of potassium ferricyanide in bamboo vinegar with different concentrations

2.4 竹醋液羟自由基清除能力

依据上述实验方法得到吸光度值后，计算羟自由基清除率，以竹醋液浓度为横坐标作图4。加入竹醋液后羟自由基有显著的减少。竹醋液对羟自由基清除率的大小随其浓度的增加而增加。羟自由基清除率是反映抗氧化剂抗氧化能力的重要指标。因此，本实验结果可作为竹醋液具有抗氧化作用的证据。

图4 不同浓度竹醋液对羟自由基清除率

Fig.4 Removal rate of hydroxyl radicals by bamboo vinegar with different concentrations

3 结论

由于物质的抗氧化活性与过氧化物生成的原因以及评价方法的原理之间有着复杂的联系，所以目前并没有能够全面描述物质的抗氧化活性的评价方法。现有研究中所使用的抗氧化活性评价方法较为多样，没有形成较为成熟的标准体系。如对潜在抗氧化剂进行科学评价，可采用多项测量指标全面评价其抗氧化的研究方法。本文分别研究了竹醋液对于超氧阴离子自由基的清除能力、对于DPPH自由基的清除能力、对于铁氰化钾的还原能力以及对羟自由基的清除能力。本文通过不同稀释浓度的竹醋液原液在四种抗氧化活性评价实验中的具体表现证明了竹醋液对超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基有显著的清除作用，且对于铁氰化钾具有显著的还原能力，并且此能力随浓度增加而增长。结合林小兰等^[19]使用竹醋液对常温贮藏砂糖橘的保鲜效果研究，以及韩紫音等^[20]使用竹醋液对冷却猪肉的复合保鲜的研究结论，本研究证明了竹醋液原液确有显著的体外抗氧化活性，能够为竹醋液在食品工业中开发和应用天然抗氧化剂、保鲜剂、防腐剂等产品提供理论依据。

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第一作者：李婕（1988—），女，汉族，天津人，硕士，工程师，主要从事食品安全检测工作，E-mail: Regina0715@163.com

通信作者：柴铭骏（1983—），男，汉族，天津人，硕士，高级兽医师，主要从事食品安全检测工作，E-mail: 51904014@qq.com

1. 天津海关动植物与食品检测中心 天津 300450

1. The Animal, Plant & Foodstuff Inspection Center of Tianjin Customs, Tianjin 300450