贺生芳 姜肖军 陈林军 郝俊虎

Abstract According to the vhlA gene of Mycoplasma synoviae (MS) and PvpA gene of Mycoplasma gallisepticum (MG), the specific primers and TaqMan-MGB probes were designed and synthesized. By optimizing the reaction system and procedures, a dual fluorescence quantitative PCR method that could simultaneously detect MS and MG was established. The results showed that the method had good specificity and did not cross-react with other common chicken pathogens. The recombinant plasmid containing MS vhlA gene and MG PvpA gene was used as template to draw the standard curve, and the correlation coefficients (R²) were 0.996 and 0.995, respectively, with a good linear relationship. The coefficients of variations of inter-group data were＜2%, and the limit detection of this method was 10 copies/μL. The detection results of clinical samples were consistent with those of the duplex quantitative real-time PCR adopted by the World Organisation for Animal Health (WOAH). It shows that the established TaqMan-MGB duplex real-time PCR has strong specificity and high sensitivity, and can be used for rapid detection of clinical samples.

Keywords Mycoplasma synoviae; Mycoplasma gallisepticum; TaqMan-MGB duplex real-time PCR

支原体病于1936年首次在家禽中被报道，目前已知有120多种支原体，有20多种可以感染禽类宿主^[1]，其中对家禽养殖危害最大的支原体是鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）和鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）。鸡滑液囊支原体主要引起家禽关节、腱鞘以及气囊的炎症和蛋壳顶端异常^[2]，鸡毒支原体又称鸡败血支原体，主要引起家禽的传染性鼻窦炎等慢性呼吸道疾病^[3]。禽支原体感染使家禽养殖业的生产力下降10%～20%、胚胎死亡率增加5%～10%^[4]，家禽在感染支原体后，在鸡群内迅速传播、持续循环，严重降低鸡群抵抗力，使鸡群继发其他病原感染，进一步形成更大的损失。

快速准确的检测手段有助于实现禽支原体的早期诊断和快速控制，目前对于禽支原体的检测方法包括病原的分离、血清学检测方法、分子生物学检测方法，分离鉴定是支原体诊断的“金标准”，但是培养周期长，对人员、环境、培养基要求高，不适用于临床快速诊断，血清学检测方法特异性和灵敏性低，易出现交叉反应^[5]。与传统方法相比，分子生物学方法直接检测细菌本身或其基因组，特异性更高、灵敏度更高，因此本研究设计了针对MS和MG的2对特异性引物和2条探针，建立了可同时快速检测MS和MG两种病原核酸的TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法，旨在为两种病毒的临床快速检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源

鸡滑液囊支原体MS山东分离株（MS-sd）和鸡败血支原体MG F毒株（MG-F）的DNA基因组由兰州兽医研究所鉴定、保管，大肠杆菌CICC10305、鸡白痢沙门氏菌由本实验室保存，禽流感病毒H7亚型核酸质控品、鸡新城疫核酸质控品、禽白血病（ALV-J）核酸质控品购于普道（北京）标准技术有限公司，火鸡支原体标准菌株、衣阿华支原体标准菌株购于国家兽医微生物菌（毒种）保藏中心。鸡泄殖腔拭子由本实验室收集保存。

1.1.2 仪器设备及试剂

荧光定量PCR仪stepone plus，购自ABI公司；PCR仪Vreiti 96 well Cycle，购自ABI公司；电泳仪PowerPac Basic，购自BIORAD公司；凝胶成像仪chemiDoc XRS+，购自伯乐公司；高速冷冻离心机Centrifuge 5430R，购自艾本德公司。荧光定量PCR反应液Probe qPCR Mix、DNA Maker、PCR反应液、pGEM-Teasy载体、感受态细胞、质粒提取试剂盒购自Takara；细菌基因组DNA提取试剂、病毒RNA提取试剂盒购自北京亿森宝生物科技有限公司，所用引物和探针均由生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.3 临床样本

从进境种鸡以及宁夏周边养殖场采集病鸡泄殖腔拭子样品共计30份，经过反复挤压洗脱后，液体进行DNA备用。

1.2 方法

1.2.1 引物设计和合成

根据GenBank公布的鸡滑液囊支原体病毒 vhlA基因序列（No.KU572344.1）、鸡败血支原体病毒 PvpA基因序列（No.AE015450.2），用Primer premier5软件对其保守区域分别设计特异性引物和探针1组（表1），设计的引物序列通过GenBank进行BLAST比对分析，挑选出特异性最高的引物序列，由生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.2 核酸样本提取

采用细菌DNA提取试剂盒提取pGEM-MS-vhlA、pGEM-MG-PvpA、大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、火鸡支原体标准菌株、衣阿华支原体标准菌株的基因组DNA，采用病毒基因组RNA提取试剂盒提取禽流感病毒H7亚型核酸质控品、鸡新城疫核酸质控品、禽白血病（ALV-J）核酸质控品的基因组RNA，置于-20℃备用。

表1 引物和探针的序列

Table 1 The sequences of the primers and probes

1.2.3 重组质粒标准品的制备

以MS-sd和MG-F的DNA基因组为模板，利用特异性引物，分别进行PCR扩增，扩增后所得产物分别连接在pGEM-Teasy克隆载体中，经过转化、酶切、测序验证得到的重组质粒标准品，分别命名为pGEM-MS-vhlA、pGEM-MG-PvpA，并用核酸浓度检测仪测定其浓度，按下列计算公式将浓度换算为拷贝数：copies/μL＝（6.02×10²³）×（质粒浓度×10^-9）/（3660×660）。

1.2.4 双重荧光定量PCR扩增条件优化

建立20 μL的荧光定量PCR反应体系，其中2×Probe qPCR Mix 10 μL，将pGEM-MS-vhlA、pGEM-MG-PvpA重组质粒标准品分别稀释成浓度为1×10³ copies/μL，混合后取5 μL作为模板，10 μmol/L上下游引物体积分别为0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL、1.0 μL、1.2 μL、1.4 μL，10 μmol/L探针体积分别为0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL、1.0 μL、1.2 μL、1.4 μL，进行不同引物、探针浓度交叉配比试验，退火温度设定范围为58～62℃，根据Ct值和扩增曲线，筛选出双重荧光定量PCR最佳反应体系。

1.2.5 标准曲线的建立与灵敏度试验

提取 pGEM-MS-vhlA、pGEM-MG-PvpA两种重组质粒标准品DNA，稀释为相同浓度，然后10倍梯度稀释，将浓度为1×10¹ ～1×10⁵ copies/μL的两种重组质粒标准品混合后作为模板，加入到优化好的反应条件进行双重荧光定量PCR扩增，以混合重组质粒标准品浓度为横坐标，Ct值为纵坐标，建立标准曲线；将浓度为1×10^-1～1×10⁵ copies/μL的混合重组质粒标准品作为模板，按照优化好的反应条件进行双重荧光定量PCR扩增，确定该方法的最低检出限。

1.2.6 特异性试验

以大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、禽流感病毒H7亚型核酸、鸡新城疫核酸、禽白血病（ALV-J）核酸，火鸡支原体核酸、衣阿华支原体核酸为模板，同时以重组质粒标准品pGEM-MS-vhlA、pGEM-MG-PvpA作为对照，应用本方法建立的双重荧光定量PCR方法进行检测，确定本方法的特异性。

1.2.7 重复性试验

将浓度为1×10³ copies/μL、1×10⁴ copies/μL、1×10⁵ copies/μL的混合重组质粒标准品为模板，应用建立好的TaqMan-MGB双重荧光定量PCR方法进行扩增，对每个浓度的模板进行3次重复，进行组内的重复性试验，设混合重组质粒标准品模板3份，进行组间的重复性试验，同时计算组内和组间的变异系数。

1.2.8 临床样本的检测

取采集保存的鸡咽喉拭子30份样品，提取基因组DNA，分别用建立的双重荧光定量PCR方法和WOAH中采纳的双重荧光定量PCR方法进行检测，比较两种方法的检测结果，以此验证建立方法的可行性与可靠性。

2 结果

2.1 重组质粒标准品的制备

以MS-sd和MG-F的DNA基因组为模板，利用设计的引物进行PCR扩增，获得预期大小的片段，连接克隆载体后，重组质粒标准品pGEM-MS-vhlA酶切后目的条带为1768 bp和3015 bp（图1），测得浓度为5.03 μg/mL，即9.59×10¹¹ copies/μL，重组质粒标准品pGEM-MG-PvpA酶切后目的条带为645 bp和3015 bp（图1），测得浓度为4.87 μg/mL，即1.21 ×10¹² copies/μL。

M: DL5000DNA 分子量标准;

1. 重组质粒pGEM-MS-vhlA; 2. 重组质粒pGEM-MS-vhlA酶切鉴定; 3. 重组质粒pGEM-MG-PvpA; 4. 重组质粒pGEM-MG-PvpA酶切鉴定

图1 重组质粒酶切鉴定

Fig.1 Digestion identification of recombinant plasmid

2.2 双重荧光定量PCR扩增条件优化

经条件优化，双重荧光定量PCR扩增条件为：2×Probe qPCR Mix 10 μL，模板DNA 5 μL，10 μmol/L上、下游引物和10 μmol/L探针各1.0 μL，ddH₂O 补充到总体积为20 μL，扩增程序为95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s，40个循环，在492 μm收集FAM荧光信号，575 μm收集ROX荧光信号，获得的Ct值最小，扩增曲线呈现典型的S型。

2.3 标准曲线的建立

如图2所示，针对MS qPCR的标准曲线的线性方程为Y＝-3.33X + 37.90，其相关系数R²为0.996，斜率为-3.33；针对MG qPCR的标准曲线的线性方程为Y＝-3.23X + 38.29，其相关系数R²为0.995，斜率为-3.238，表明两种重组质粒标准品的拷贝数均与各自的Ct有良好的线性关系。

图2 双重荧光定量PCR标准曲线

Fig.2 The standard curve of duplex real-time PCR

2.4 灵敏度试验

按照优化好的双重荧光定量扩增反应体系及反应条件对混合重组质粒标准品进行检测，结果如图3所示，该方法对两种支原体的最低检出限均为1×10¹ copies/μL，且梯度均一，说明所建立的方法具有较高的灵敏度，可以检出病毒含量较少的样本。

2.5 特异性试验

结果如图4所示，所建立的方法仅对含有MS、MG的模板有特异性扩增，其他模板均未出现特异性扩增，表明建立的方法具有良好的特异性。

2.6 重复性试验

以3个浓度的pGEM-MS-vhlA和pGEM-MG-PvpA重组质粒标准品混合后为模板，分别进行组内和组间的重复性试验，结果表明，pGEM-MS-vhlA重组质粒标准品批内变异系数范围为0.79%～1.21%，批间变异系数范围为0.25%～1.40%，pGEM-MG-PvpA重组质粒标准品批内变异系数范围为0.18%～1.48%，批间变异系数范围为0.10%～0.72%，两种重组质粒标准品组内和组间的变异系数均小于2%，表明所建立的方法具有较好的重复性。

2.7 临床样品检测

采用建立的双重荧光定量PCR方法检测30份样品，经检测有5份MS为阳性，阳性率为16.67%，有6份为MG阳性，阳性率为20.00%，混合感染2份，阳性率6.67%，与世界动物卫生组织（WOAH）推荐的荧光定量PCR方法进行比较，两种病毒的阳性符合率均为100%。阳性样品产物送往上海生物工程有限公司进行测序分析，测定的序列与GenBank中序列比对分析，阳性产物序列与已发表的MS或MG的序列100%同源。

3 讨论

鸡滑液囊支原体和鸡毒支原体由于既能垂直传播又能横向传播，这对于家禽养殖业有较大影响，其感染后症状不明显，临床中难以及时通过症状确诊并采取相应措施。国内主要通过接种疫苗和药物预防来控制该病的发生和传播，目前国内养禽企业通过不断的监测和净化，力图培养无疫禽群^[6]。因此，本研究根据鸡滑液囊支原体和鸡毒支原体的特异性基因片段建立了能快速、高效、精准地检测两种疾病的双重荧光定量PCR方法，为两种病原的检测和净化提供了新的技术。

国内针对MS和MG的双重检测，建立了普通PCR方法以及双重荧光定量PCR检测方法，如朱小甫等^[7]、杨美等^[8]分别建立了MS和MG双重PCR方法，如高志强等^[9]、胡欣月^[10]分别建立了基于TaqMan双重荧光定量检测方法。TaqMan荧光定量技术具有敏感性高、特异性强、重复性好等特点，在TaqMan荧光定量技术上发展起来的MGB新型探针技术，可以将探针的Tm值提高10℃左右，使得较短的探针达到较高的Tm值，短探针的荧光报告集团和淬灭集团的距离更近，荧光本底低，分辨率更高，特异性更强^[11]，此外，较短的探针增大可检测靶基因范围，增加方法的可信性^[12]。本研究建立的可同时检测MS和MG的双重荧光定量PCR方法，采用TaqMan-MGB探针，对pGEM-MS-vhlA、pGEM-MG-PvpA重组质粒标准品的最低检测拷贝数均为10 copies/μL，WOAH推荐的TaqMan荧光定量PCR方法对MS和MG的最低检测拷贝数分别为1 copies/μL和10 copies/μL。利用应用本研究建立的双重荧光定量PCR方法对实验室保存的30份样本进行检测，其中有2份同时检测到了MS和MG阳性，经过测序比对，其与GenBank中已发表的序列100%同源，说明在临床上存在同时感染MS和MG的病例。在临床研究检测中发现禽支原体病毒单独感染会引起雏鸡育成率下降和产蛋率下降，不会引起严重发病，但若和其他病毒或细菌混合感染，会引起严重的并发症，影响鸡群健康^[13-14]，混合感染的严重性在于病原体的多样性和复杂性，有研究表明在复杂的背景基因组DNA的影响下，所建立的PCR反应体系检测灵敏度会受到不同程度的影响^[15-16]，因此本研究所建立的方法应进一步验证抗干扰性。

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MS 1～7: 1×10^-5～1×10^-1copies/μL; 8: 阴性对照

MG 9～15: 1×10^-5～1×10^-1copies/μL; 16: 阴性对照

图3 双重荧光定量PCR的灵敏度试验

Fig.3 The sensitivity assay of duplex real-time PCR

1.鸡滑液囊支原体病毒; 2.鸡毒支原体病毒; 3～9分别为大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、禽流感 (H7) 病毒核酸、鸡新城疫病毒核酸、禽白血病 (ALV-J) 病毒核酸、火鸡支原体核酸、衣阿华支原体核酸

图4 双重荧光定量PCR的特异性试验

Fig.4 The specificity assay of duplex real-time PCR

表2 双重荧光定量PCR的重复性试验

Table 2 The repeatability assay of duplex real-time PCR