王红 李晓宾 李君萍 王文娟 郭红丽 杨玉

蚊媒病毒传染病是一类由蚊虫为传播媒介而引发的病毒性传染病，传播的病毒病原体可由蚊虫传播给人类及动物宿主，引起基孔肯雅热、登革热、西尼罗热等疾病^[1-2]。登革病毒（Dengue virus，DENV）属于黄病毒科、黄病毒属、单股正链RNA 病毒，传播媒介为伊蚊，登革病毒感染病例广泛流行于热带和亚热带地区，全球每年有5000万至1亿病例^[3-4]，我国于1978年在广东福山首次发现登革病毒，之后在海南、福建、广西、云南、浙江等地均有发现。寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）属黄病毒科，黄病毒属，单股正链RNA病毒，传播媒介为伊蚊^[5]。截至2017年1月，全球范围内共有75个国家报道发现ZIKV感染病例。2016年2月我国确诊了中国大陆首例境外输入性ZIKV感染病例^[6]，随后在广东、浙江、北京等地相继出现输入性病例^[5]。西尼罗病毒（West Nile Virus，WNV）属于黄病毒科、黄病毒属，RNA为正链，主要流行于非洲、美洲、欧洲、中东和澳大利亚等地，已成为全球流行疾病^[7]，2009年该病首次在中国被发现^[8]。蚊媒病毒传染病在全球广泛流行或者区域流行，特别是热带欠发达地区，对人类健康和经济构成了巨大威胁，长期以来一直是全球严重的公共卫生问题之一。蚊媒病毒的监测主要依靠实验室检测，近年来随着多重荧光PCR技术的不断完善，能够更加快速准确地发现蚊媒病毒，为蚊媒传染病的预防和控制提供了新的手段。本研究提出了基于多重荧光PCR技术的多重病原体组合，针对蚊媒传染病中的登革病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）、西尼罗病毒（WNV），建立一种可同时检测3种病原体的分子检测方法，以期为口岸蚊媒病毒传染病的监测提供重要的技术支撑和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

3种蚊媒病毒基因包括登革病毒血清型Ⅱ型的3 '-UTR基因片段、寨卡病毒的polyprotein基因以及西尼罗病毒的NS5基因，系采用人工方法合成并克隆到质粒上，质粒委托通用生物（安徽）股份有限公司合成。本研究使用的病毒参考品购自中国食品药品检定研究院。

1.2 试剂与仪器

OneStepRT-PCR试剂（江苏硕世公司），QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取试剂（Qiagen公司），逆转录酶SuperScript™ⅢReverse Transcriptase（ThermoFisher公司），DNA聚合酶Platinum™ Taq DNA Polymerase（ThermoFisher公司），dNTP Mix（Promega公司）， ABI QuantStudio7Flex荧光PCR仪（美国ABI公司），NanoDrop 2000c分光光度计（Thermo Scientific公司）。

1.3 引物及探针设计

根据GenBank中的基因数据，运用Bioedit Sequence Alignment Editor软件中的ClustalW multiple alignment程序分别对3种病原体的基因序列DENV保守区（3' -UTR）、ZIKV（polyprotein gene）、WNV（NS5 gene）进行比对分析后获取保守序列，根据引物设计原则，设计引物和探针，探针的5'端分别标记FAM、VIC、ROX荧光基团，3'端标记相应的淬灭基团BHQ1、BHQ2、BHQ3。引物、探针由百力格生物公司合成并标记，具体见表1。

表1 引物和探针信息

Table 1 Primer and probe details of PCR

1.4 多重荧光PCR反应条件优化

1.4.1 反应体系的优化

多重荧光PCR反应体系的引物探针浓度共设计4组浓度梯度进行组合优化， 分别是组1（引物和探针浓度分别是600 nmol/L∶400 nmol/L）、组2（引物和探针浓度分别是400 nmol/L∶200 nmol/L）、组3（引物和探针浓度分别是200 nmol/L∶100 nmol/L）、组4（引物和探针浓度分别是100 nmol/L∶100 nmol/L），以1.0×10⁷拷贝/mL和1.0×10⁴拷贝/mL的质粒为模板，通过扩增曲线和循环数阈值（Cycle threshold，Ct）分析引物和探针浓度对多重荧光PCR检测的影响。反应体系25 μL， OneStep RT-PCR扩增反应液7.5 μL、Enzyme Mix酶混合液5 μL、引物探针检测液7.5 μL、模板核酸5 μL，反应条件：50℃逆转录30 min；95℃预变性5 min；95℃变性10 s，退火温度55℃退火延伸40 s，45个循环。

1.4.2 扩增程序的优化

对多重荧光PCR体系设置3组退火温度，分别以55℃、58℃和60℃作为反应的退火延伸温度，完成荧光PCR反应，通过扩增曲线分析退火延伸温度对多重荧光PCR检测的影响。反应条件：50℃逆转录30 min；95℃预变性5 min；95℃变性10 s，退火温度退火延伸40 s，45个循环；在退火延伸阶段收集荧光信号。

1.5 性能评价

1.5.1 灵敏度试验

利用含特异性片段的质粒进行稀释后，浓度分别为1.0×10¹ 拷贝/mL、1.0×10²拷贝/mL、1.0×10³ 拷贝/mL、1.0×10⁴ 拷贝/mL、1.0×10⁵ 拷贝/mL、1.0×10⁶ 拷贝/mL、1.0×10⁷ 拷贝/mL、1.0×10⁸ 拷贝/mL，每个浓度设置3个平行样进行荧光PCR检测，运用Excel对阳性结果数据进行分析，筛选出95%以上阳性检出率的浓度梯度，选择符合95%以上阳性检出率的最低浓度的质粒作为检出限验证质粒，将质粒稀释至最低检出限浓度，取4份，每份重复检测24次，总检测次数为96次，观察其最低检出限。

1.5.2 特异性试验

在经过Blast程序及Bioedit对各引物和探针的特异性进行初步分析和验证的基础上，进一步检测所设计的引物和探针，以黄热病毒、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、登革病毒和西尼罗病毒等参考品提取的核酸为模板，对本研究建立的方法进行特异性试验。

1.5.3 精密度试验

对重组质粒稀释至浓度1.0×10⁶ 拷贝/mL和1.0×10³ 拷贝/mL，进行重复性检测。每个浓度设置10个平行样，计算各病毒对应的各浓度的Ct值平均值及标准差，并计算变异系数来检验反应体系的精密度。

1.6 统计学方法

运用Excel对数据进行分析，计算出模板拷贝数的对数值为横坐标（X），分别计算各浓度复孔的平均Ct值为纵坐标（Y），建立标准曲线。根据标准曲线计算各检测方法灵敏度或检出限。并对3个平行样的Ct值计算均数及标准差，计算标准差与均数的比值得到3个平行样之间Ct值的变异系数。

2 结果与分析

2.1 多重荧光PCR反应条件优化结果

2.2.1 引物和探针浓度优化

本实验设计了4组引物和探针的浓度梯度，4组不同浓度的引物和探针对1.0×10⁴ 拷贝/mL和1.0×10⁷ 拷贝/mL质粒均可检出，当3种蚊媒病毒引物和探针浓度分别为600 nmol/L和400 nmol/L，组1的Ct值较小，因此选择组1作为反应体系最佳引物和探针用量。

2.2.2 退火温度优化

经对荧光PCR反应过程退火温度55℃、58℃、60℃进行优化，3个温度下对1.0×10⁴ 拷贝/mL和1.0×10⁷ 拷贝/mL的质粒均可检出，检测结果无差异，不同的退火温度对检测结果影响不明显。为提高特异性，后续实验选择60℃作为退火温度，即50℃，30 min；95℃，5 min；95℃，10 s；60℃，40 s，45个循环。在 60℃，40 s阶段收集荧光。

表2 引物和探针浓度对荧光PCR扩增的影响

Table 2 Effects of primer and probe concentration on multiplex fluorescent PCR amplification

表3 退火温度对荧光PCR扩增的影响

Table 3 Effects of annealing temperature on multiplex fluorescent PCR amplification

2.3 灵敏度验证

利用含特异性片段的质粒将浓度分别稀释为1.0×10¹ 拷贝/mL、1.0×10² 拷贝/mL、1.0×10³ 拷贝/mL、1.0×10⁴ 拷贝/mL、1.0×10⁵ 拷贝/mL、1.0×10⁶ 拷贝/mL、1.0×10⁷ 拷贝/mL、1.0×10⁸ 拷贝/mL，每个浓度设置3个平行样进行荧光PCR检测，1.0×10³ 拷贝/mL的质粒阳性检出95%以上，因此，1.0×10³ 拷贝/mL质粒作为用于验证本反应体系的最低检测限。用3种蚊媒病毒多重荧光PCR反应体系对最低检测限验证，稀释4份最低检测限1.0×10³ 拷贝/mL浓度的质粒，每份重复检测24次，总检测次数为96次，观察其最低检出限。实验结果见表4，对实验结果进行统计分析，浓度为1.0×10³ 拷贝/mL的质粒检出率分别都大于95%。因此，本研究建立的多重荧光PCR反应体系的灵敏度确定为1.0×10³ 拷贝/mL。

表4 各重组质粒检测的灵敏度

Table 4 The detection sensitivity of each recombinant plasmid

2.4 特异性试验结果

3种病原体的引物和探针之间做交叉实验进行实时荧光PCR特异性验证，登革病毒（Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型）、寨卡病毒和西尼罗病毒样本均为阳性扩增，黄热病毒、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、基孔肯雅病毒无非特异性扩增，扩增结果见表5。由实验结果可以看出，本研究所建立的多重荧光PCR方法无特异性扩增。

2.5 重复性试验结果

采用3种病原体的重组质粒（1.0×10³ 拷贝/mL和1.0×10⁶ 拷贝/mL）进行重复性检测。每个浓度设置10个平行样，计算各病毒对应的各浓度的Ct值平均值及标准差，并计算变异系数来检验反应体系的重复性。结果表明：各体系的变异系数都小于5%，详细结果见表6。该结果显示本研究建立的多重荧光PCR方法的可重复性良好。

表5 多重荧光PCR在各病原体间的检测特异性

Table 5 Detection specificity of multiplex fluorescent PCR among pathogens

注: “+”代表阳性; “-”代表阴性

表6 多重荧光PCR方法对各重组质粒检测的精密度

Table 6 Precision of multiplex fluorescent PCR for detection of each recombinant plasmid

3 讨论

近年来，多种蚊媒传染病在全球各地相继暴发。目前已发现有数百种已知病毒可通过节肢动物进行传播，其中约150种会导致人类疾病，蚊媒传染病对全球各国的威胁日益扩大，多种由蚊媒病毒引发的疾病大流行已成为全球突发公共卫生事件^[1-2]。随着国际交流的日益频繁，蚊媒病毒传入我国的可能性逐渐增大，准确检测蚊媒种群中的病毒并特异性诊断人或动物宿主是否感染，是传染病防控策略的重要部分，这将有助于对潜在或正在发生的疫情进行早期预警。登革病毒、寨卡病毒和西尼罗病毒均属黄病毒属，且在我国均有发现，因此，针对这3种蚊媒病毒建立合适的检测方法，对于蚊媒传染病的预防控制具有重大意义。

本研究通过优化扩增体系中引物浓度、探针浓度和退火温度等参数，构建出一种可同时检测登革病毒、寨卡病毒和西尼罗病毒的三重荧光PCR检测体系，并对重复性、特异性、最低检出限进行验证，其体系各引物和探针最佳浓度分别为600 nmol/L和400 nmol/L，最佳退火温度为60℃，对病原体的检出限为1.0×10³ 拷贝/mL，无非特异性扩增，各体系的变异系数均小于5%，具有检测时效高、特异性强、灵敏度高等优势，可为我国口岸蚊媒传染病的监测工作提供技术支撑。

参考文献

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[2] Cleton N, Koopmans M, Reimerink J, et al. Come fly with me: review of clinically important arboviruses for global travelers[J]. Journal of Clinical Virology, 2012, 55(3): 191-203.

[3]阮倩倩, 孙九峰. 我国登革热疾病负担研究进展[J]. 中山大学学报(医学科学版), 2023, 44(5): 721-727.

[4] Heddini A, Janzon R, Linde A. Increased number of Dengue cases in Swedish travellers to Thailand[J]. Euro Surveill, 2009, 14(5): 19111.

[5]管晓庆, 陈志海. 寨卡病毒病研究进展[J]. 传染病信息, 2017, 30(1): 15-19.

[6]李建华, 黄仁发, 杨健平. 中国大陆首例输入性寨卡病毒感染病例临床表现及实验室检测结果分析[J]. 中国公共卫生, 2016, 32(4): 413-415.

[7]孙静, 何展, 蔡畅, 等. 西尼罗河病毒感染与免疫机制研究进展[J]. 中国兽医学报, 2021, 41(10): 2059-2063.

[8] Yu X J, Liang M F, Zhang S Y, et al. Fever with thrombocytopenia associated with a novel Bunya virus in China.[J]. The New England journal of medicine, 2011, (16): 364.

第一作者：王红（1966—），女，汉族，山西晋中人，本科，副主任技师，主要从事口岸卫生检疫工作及传染病检测技术研究，E-mail: wanghongall@163.com

通信作者：杨玉（1982—），女，汉族，河南新乡人，本科，副主任医师，主要从事口岸卫生检疫工作及传染病防控研究，E-mail: 55581539@qq.com

1. 山西国际旅行卫生保健中心（太原海关口岸门诊部） 太原 030021

1. Shanxi International Travel Health Care Center (Taiyuan Customs Port Outpatient Department), Taiyuan 030021