任宏彬 张鑫鑫 杨晓伟 贾晓婷 李霖

氯霉素类药物价格低廉，疗效好，具有广谱抗生素效果，但在水产养殖过程过量使用会使药物残留在水产品组织中，人体摄入积累可能会引起再生性贫血，抑制人体骨髓造血功能等，对健康构成危害。农业农村部第250号公告《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》中规定，氯霉素及其盐、酯等均属于食品动物中禁止使用的药品。

目前，动物源性食品中的药物残留检测的前处理多为提取、浓缩、净化等步骤。提取根据分析物性质采用不同提取试剂，并借助匀浆、震荡、超声等辅助方式；浓缩可通过旋蒸，氮吹等手段进行；净化方式有固相萃取净化、脱脂净化、QuEChERS（Quick，Easy，Effective，Cheap，Rugged and Safe）净化等，其中，固相萃取净化操作步骤多，耗费时间长，试剂耗材成本也较高；脱脂净化简便易行，但对于复杂基质样品净化效果欠佳；而QuEChERS净化可在保证净化效果的前提下，有效缩短前处理时间，节约试验成本，具有操作相对简便、处理速度快、分析范围广等优点，已广泛应用于动物源性食品中药物残留的检测。LC-MS/MS作为检测药物残留的主要手段具有灵敏度高、专一性强和准确度高等优点，但在离子化过程中，提取液中内源性或外源性物质易与分析物发生竞争电荷和中和离子化现象，可能会对分析物的信号响应产生抑制或增强现象，即基质效应（Matrix Effect，ME），从而影响定量结果的准确性^-。消除基质效应的方法主要有内标法、基质匹配法等。基于上述检测特点，试验采用QuEChERS净化结合LC-MS/MS检测鱼肉中的氯霉素残留，对比溶剂外标法、基质外标法、溶剂内标法、基质内标法4种定量方法，分析不同定量方法在氯霉素检测过程中的基质效应及对回收率的影响，从而选择最佳定量方法，实现高效、准确检测鱼肉中氯霉素残留的目的。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

LCMS-8050液相色谱-串联质谱仪、Shim-pack GIST C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm，2 μm）均购于日本Shimadzu公司；ST-40R高速冷冻离心机购于美国Thermo公司；Vortex Genie 2涡旋混合器购于美国Scientific Industries公司；BSA224S-CW电子天平购于德国Sartorius公司；Auto EVA氮吹仪购于Reeko公司。

1.2 试剂与对照品

甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色谱纯）购于北京迪马欧泰科技有限公司；石墨化炭黑（40～120 μm）、十八烷基键合硅胶吸附剂C₁₈（40～60 μm）、乙二胺-N-丙基硅烷PSA（40～60 μm）购于上海格滤环境科技有限公司；氯霉素、氯霉素-D₅标准溶液（100 μg/mL）购于坛墨质检科技股份有限公司。

1.3 试验设计

1.3.1 标准工作液的配制

标准溶液氯霉素和氯霉素-D₅分别用甲醇稀释配制成浓度为1 μg/mL的中间液，于4℃避光保存，有效期1个月，使用前用甲醇稀释得到浓度为100 ng/mL的氯霉素-D₅内标工作液。氯霉素中间液用水溶液或空白样品提取液稀释后分别加入同体积的氯霉素-D₅内标工作液，得到氯霉素浓度为1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL的氯霉素系列标准工作液，氯霉素-D₅浓度均为10 ng/mL。

1.3.2 样品前处理

提取：取鱼肉组织打碎均质成肉糜状，称5.00 g于50 mL离心管中，加入内标工作液500 μL，用10 mL乙酸乙酯涡旋提取1 min，超声提取5 min，以5000 r/min离心5 min，上清液转移至试管中，残渣加入10 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并上清液。

净化：合并后的上清液在40℃水浴下氮吹至干，用5 mL水溶解残渣，溶解液转移至含有0.1 g PSA的15 mL离心管中，涡旋30 s，以8000 r/min离心3 min后取水相过微孔滤膜至进样瓶中待上机分析。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Shim-pack GIST C₁₈（100 mm×2.1 mm，2 μm）；柱流量：0.3 mL/min；柱温：40℃；进样体积：10 μL；流动相A为水，流动相B为甲醇，等度洗脱，A∶B = 4∶6。

1.3.4 质谱条件

扫描方式：负离子扫描；接口电压4.0 kV；雾化气：氮气，3 L/min；加热气流量：10 L/min；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；碰撞气：氩气，270 kPa；检测方式：多反应监测模式，主要质谱参数见表1。

表1 主要质谱参数

Table 1 Main mass spectrum parameters

注: *用于定量

2 结果与分析

2.1 样品前处理优化

试验对比了甲醇、乙腈和乙酸乙酯的提取效果，氯霉素均易溶于其中，甲醇、乙腈与水互溶，但乙酸乙酯与水难溶，使得乙酸乙酯作为提取液时吸收样品水分少，氮吹浓缩过程更为迅速、彻底；对于批量样品处理过程，氮吹浓缩可多样品试管同时进行，比旋蒸浓缩效率更高，且不易交叉污染，因此，试验选择乙酸乙酯作为提取液，通过氮吹方式进行浓缩。

2.2 流动相选择

试验首先比较流动相组合乙腈-水和甲醇-水对氯霉素的色谱峰形和分离度的影响，发现均获得了较好的信号响应，仅出峰时间略有差异，前者出峰时间略早，但后者峰型更加尖锐对称，这是由于乙腈相较于甲醇极性稍弱，在固定相极性较低的C₁₈色谱柱上洗脱能力更强，反而易造成分析物出峰较早，虽可节省一定时间，但可能会影响分析物峰型和稳定性^[3]。其次，考察流动相组合甲醇-水和甲醇-乙酸铵溶液（5 mmol/L），发现甲醇-乙酸铵相较于甲醇-水虽可在一定程度上提高信号响应值，但分析物峰型受到明显影响，且出现杂峰干扰，影响定量分析。因此，试验选择甲醇-水作为流动相进行洗脱。

2.3 吸附剂选择

试验将氮吹浓缩后的溶解液进行QuEChERS净化，对比石墨化炭黑、C₁₈、PSA吸附剂的净化效果，取空白鱼肉样品添加相同浓度（1 μg/kg）的分析物进行提取浓缩，分别使用0.1 g石墨化炭黑、C₁₈、PSA吸附剂进行净化处理，通过回收率考察吸附效果。结果如图1所示，使用石墨化炭黑、C₁₈和PSA吸附剂回收率逐渐提高，试验中发现石墨化炭黑和C₁₈出现了不同程度的粘连和堆积，可能影响了净化效果，使用PSA吸附剂净化回收率达90%以上，可满足试验要求。

图1 不同吸附剂净化的回收率（n = 6）

Fig.1 Purification recovery rate of different adsorbents (n = 6)

2.4 吸附剂用量优化

通过参考相关文献和标准，对净化吸附剂PSA的用量进行优化，通过回收率比较不同PSA用量对检测结果的影响，将空白鱼肉样品添加相同浓度（1 μg/kg）的分析物进行提取浓缩后分别加入0.02 g、0.05 g、0.1 g、0.12 g、0.15 g PSA进行净化处理。结果如图2所示，回收率随着PSA吸附剂使用量的增加逐步提高，PSA用量为0.1 g时回收率达到90%，随后基本保持不变，综合回收率和成本考虑，选择0.1 g PSA进行净化处理。

2.5 净化方式优化

在确定提取方法和吸附剂的前提下，通过加标回收率来比较正己烷脱脂净化^[3]、固相萃取净化和QuEChERS净化3种不同净化方式对净化效果的影响，按照GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》对食品中的禁用物质要求做三水平加标回收试验，并确定线性范围（1～20 ng/mL）。取鱼肉空白样品，分析物添加浓度分别为0.2 μg/kg、0.5 μg/kg、2 μg/kg，提取后按照3种不同方式净化，每个浓度重复测定6次，结果见表2。

结果表明，固相萃取净化和QuEChERS净化效果优于正己烷脱脂净化，且分析物杂峰干扰小，但QuEChERS净化相较于固相萃取净化更能节约前处理时间和试验成本，因此，以QuEChERS净化方式进行样品前处理。

3 方法学考察

3.1 方法检出限和定量限

将氯霉素中间液稀释后添加到空白鱼肉样品中，按照上述选择的样品前处理方法和色谱条件进行检测，分别以3倍和10倍信噪比对应浓度确定方法的检出限和定量限，得到氯霉素的方法检出限为0.2 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg，图3为当添加浓度为0.2 μg/kg和0.5 μg/kg的氯霉素定量离子色谱图。

3.2 定量方法对结果的影响

按照试验设计中1.3.1的步骤配制标准工作液后上机检测，对比溶剂外标法、基质外标法、溶剂内标法和基质内标法4种定量方式，通过基质效应及回收率分析不同定量方式对检测结果的影响，见表3。

目前，评价基质效应的常用方法是通过在空白基质提取液和溶剂中添加分析物来进行比较，包括直接比较法和斜率比较法，直接比较法即空白基质液中分析物的峰面积响应值B与溶剂中同浓度分析物的峰面积响应值A进行比较，ME(%) = B/A×100，斜率比较法即空白基质曲线斜率B'与溶剂曲线斜率A'进行比较，ME(%)＝(B'－A' )/A'×100。本研究中标准曲线涉及多浓度点，为研究样品基质对不同浓度分析物的影响，采用斜率比较法更为客观全面。当基质效应在-20%～20%范围内时，基质效应不明显，超过20%时，表现为明显的基质增强效应，低于-20%时，表现为明显的基质抑制效应。结果如表3所示，当采用外标法时，基质效应为-10.3%，基质抑制效应不明显，但溶剂外标法平均回收率仅为37.2%，低于基质外标法平均回收率60.3%，表明采用空白基质提取液可在一定程度上提高分析物回收率，抵消部分基质效应，但回收率仍较低；当采用内标法时，基质效应为-5.27%，基质效应较低，回收率均在90%以上，与外标法相比回收率显著提高，可以满足检测要求。

为进一步验证内标法的可行性，对内标归一化基质因子进行考察，按照ME' (%) = (A/B)/(A_IS/B_IS)×100进行计算，其中，A_IS和B_IS分别代表溶剂中内标物的响应值和空白基质液中内标物的峰面积响应值。结果表明，在采用基质内标法定量时，系列浓度点内标归一化基质因子结果在88.8%～98.9%之间，RSD小于4.6%，结果较为稳定。

表4 内标归一化基质因子（n = 6）

Table 4 Internal standard normalized matrix factor (n = 6)

综上所述，当采用内标法定量时，是否采用空白基质提取液配制标准工作液对回收率影响不大，且对于批量样品检测，获取不同类别空白样品基质提取液会大幅增加工作量，降低检测效率，因此，采用溶剂内标法即可满足检测要求。

3.3 能力验证活动样品检测

为了验证方法的准确性，实验室参加了相关领域的氯霉素能力验证活动（ACAS-PT862鱼肉中氯霉素残留量的测定能力验证），按照1.3试验设计进行样品前处理和仪器条件设置，选择溶剂内标法配制标准工作液进行定量分析，检测结果见表5。能力验证结果显示，2个编号的样品检测结果均与指定值较为接近，|Z|值≤2.0，取得了满意的结果，从而有效地证明了方法的准确性。

表5 能力验证检测结果及评价

Table 5 Capability verification test results and evaluation

注: |Z|≤2.0为满意结果, 2.0＜|Z|＜3.0为可疑结果, |Z|≥3.0为不满意结果.

4 结论

本研究采用LC-MS/MS结合QuEChERS净化建立了检测鱼肉中氯霉素残留的分析方法，优化了前处理步骤，对比了不同定量方式对基质效应及检测结果的影响。结果表明，以乙酸乙酯作为提取剂，通过氮吹浓缩，QuEChERS净化，溶剂内标法定量可对鱼肉中的氯霉素进行有效测定，方法检出限和定量限分别为0.2 μg/kg和0.5 μg/kg，3个水平浓度加标下的平均回收率在88.0%～91.0%之间，相对标准偏差为3.39%～5.28%，并通过参加能力验证活动进一步验证了方法的准确性，可用于检测水产品中氯霉素的残留。

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基金项目：海关总署科研项目（2020HK217）

第一作者：任宏彬（1989—），男，汉族，山西大同人，硕士，工程师，主要从事食品安全检测研究工作，E-mail: 1193118452@qq.com

1. 太原海关技术中心 太原 030024

1. Taiyuan Customs Technology Center, Taiyuan 030024

图2 不同PSA用量净化的回收率（n = 6）

Fig.2 Purification recovery rate of different PSA dosages (n = 6)

表2 不同净化方式的回收率结果（n = 6）

Table 2 Recovery rate results of different purification methods (n = 6)

(×10³)

(×10²)

图3 不同加标浓度下的氯霉素定量离子色谱图

Fig.3 Chloramphenicol quantitative ion chromatograms at different spiking concentrations

表3 不同定量方法对检测结果的影响（n = 6）

Table 3 Effect of different quantitative methods on test results (n = 6)

注: 溶剂外标法、溶剂内标法采用水作为溶剂配制标准工作液; 基质外标法、基质内标法采用空白样品提取液作为溶剂配制标准工作液.

第一作者：杨昆（1990—），女，白族，山东枣庄人，硕士，工程师，主要从事食品安全研究工作，E-mail: 791380766@qq.com

通信作者：秦泽华（1989—），男，壮族，广西柳州人，硕士，工程师，主要从事体系评审工作，E-mail: 345984711@qq.com

1. 南宁海关技术中心 南宁 530000

2. 中国检验认证集团广西有限公司 南宁 530000

1. Technical Center of Nanning Customs District, Nanning 530000

2. China Inspection and Certification Group Guangxi Co., Ltd., Nanning 530000