杨昆 邓佳宁 徐艺溶 梁宇 黄恺 秦泽华

Abstract A high performance liquid chromatographic method for the simultaneous determination of 5-hydroxymethylfurfural, furfural and 5-methylfurfural in honey products was established. Baseline separation of these analytes was achieved within 15 min. The linear ranges for 5-hydroxymethylfurfural, furfural and 5-methylfurfural were in the ranges of 0.10-300.00 mg/kg, with correlation coefficients (r²) of 0.9998, 0.9999, 0.9997, respectively. The detection limits (S/N = 3) for three analytes were 24.6 μg/kg, 38.3 μg/kg, 51.5 μg/kg, respectively. The recoveries at spiked concentration of 0.10-10.00 mg/kg were 92.4%-103.0%. The proposed method has the merits of easy operation, fast analysis and accurate results, and is suitable for the simultaneous determination of 5-hydroxymethylfurfural, furfural and 5-methylfurfural in honey products. At the same time, this paper discusses the effects of temperature change and storage time on the content of furfural in honey products, and concludes that the temperature control should be paid attention to during the thermal processing. And honey products are not suitable for long-term storage under high temperature conditions.

Keywords honey products; high performance liquid chromatographic; 5-hydroxymethylfurfural; furfural; 5-methylfurfural

蜂蜜是一种具有较高营养价值的保健食品，含有丰富的生物活性物质，其味道鲜美，且能满足人们与日俱增的保健需求，因此蜂蜜产品的市场越来越大。蜂蜜产品在投放市场以前，都需要经过热加工处理。一方面，可以去除蜂蜜产品中的微生物和有害物质，保证产品质量安全；另一方面，可以防止蜂蜜产品结晶、发酵^[1]。但是，热加工处理也有它的弊端，因为高温会破坏蜂蜜产品的生物活性成分、维生素组成，同时可能产生5-羟甲基糠醛、糠醛和5-甲基糠醛等杂质^[2]。

5-羟甲基糠醛，又叫5-羟甲基-2糠醛，是一种有难闻气味的黑色物质。在新鲜的蜂蜜产品中，5-羟甲基糠醛的含量通常很低，它可以作为判定蜂蜜产品质量优劣的重要参数^[3]。如果蜂蜜产品中含有大量的5-羟甲基糠醛，证明该产品质量差、不够新鲜，一方面可能是蜂蜜产品涉及掺假，一方面是产品在加工过程中可能进行了高温处理^[4-5]。近年来，研究发现大量摄入5-羟甲基糠醛会有潜在的致癌性^[6]。5-甲基糠醛是一种允许使用的食品添加剂，但是相关的药理毒理研究及检测的文献较少。糠醛，目前在我国也是一种允许使用的食品用合成香料^[7]，但它具有强烈的麻醉作用及刺激性，如过量使用将存在安全隐患，产生呼吸道刺激等生理反应。若过量的糠醛类物质存在于蜂蜜产品中，会使蜂蜜颜色加深、风味改变，过多摄入将会引起中毒^[8-10]，这将在一定程度上降低蜂蜜食用的安全性。2020年版《中华人民共和国药典》的附录通则中，对5-羟甲基糠醛的限量做出了明确要求，为0.004 g/100 g。如高于限量，则产品为不合格商品。因此，快速准确测定蜂蜜产品中上述3种物质具有重要意义。

目前的国家标准中，只有液相色谱法可以对蜂蜜中5-羟甲基糠醛进行检测^[11]。在国内外的研究报道中，食品中糠醛类物质共同检测的相关文献也较少^[12-15]，其中对蜂蜜中糠醛类物质检测的参考文献更少^[16-17]。本研究建立了液相色谱法——快速测定蜂蜜产品中糠醛类物质的新方法，该方法适用于蜂蜜产品中上述3种物质的定量检测。同时，对广西地区出售的多种品牌的蜂蜜产品进行检测，探究蜂蜜产品中糠醛类物质随时间、温度变化的变化趋势。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与样品

Agilent 1260高效液相色谱仪（DAD检测器）；电子天平（XP205，梅特勒-托利多）；可调移液枪（100-1000 μL，德国eppendorf公司）；涡旋混匀器（VOTEX GENIE2，美国Scientific Industries 公司）；超纯水器（Milli - Q Reference 纯水系统，密里博美国密里博公司）。

标准品5-甲基糠醛（99.0%）、5-羟甲基糠醛（99.5%）、糠醛（99.0%），德国Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）；有机系滤膜（0.22 μm，上海安谱实验科技股份有限公司）。

1^#～15^#蜂蜜样品为广西地区出售的多种品牌的蜂蜜产品。

1.2 色谱条件

流动相：乙腈-水（10∶90）；等度洗脱；色谱柱：EC-C₁₈柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流速：0.5 mL/min；检测波长为：280 nm；柱温：30℃；进样体积：10 μL。

1.3 标准溶液的制备

配制浓度分别为1340 mg/L、2000 mg/L、1180 mg/L的5-羟甲基糠醛、糠醛、5-甲基糠醛标准储备液：称取5-羟甲基糠醛、糠醛、5-甲基糠醛标准品0.0134 g、0.0200 g、0.0118 g，用流动相乙腈-水（10∶90）溶解并定容至10 mL容量瓶中。将配制标准储备液置于4℃冰箱保存，备用。

1.4 实验方法

对蜂蜜产品进行标注1^#～15^#，并分别准确称取5 g蜂蜜产品在50 mL离心管。加入20 mL流动相溶液，涡旋混匀，振荡20 min。转移试样至50 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，充分混匀，用0.22 μm滤膜过滤，滤液供高效液相色谱仪测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 检测波长的选择

取5-羟甲基糠醛、糠醛、5-甲基糠醛配置的甲醇溶液，置分光光度计于200～800 nm波长范围内扫描，结果发现溶液在280 nm处有最大吸收，故选定280 nm为糠醛类物质的检测波长。

2.1.2 柱温的选择

对实际样品加标后，考察柱温在25℃、30℃、35℃、40℃下，糠醛、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛保留时间和选择性的变化情况。结果表明，在这些不同柱温的实验条件下，3种物质的分离情况变化不大。结合实际情况，在柱温为30℃的情况下，糠醛、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛3种物质不仅可以完成快速分离，且可以避免实际样品中杂质带来的干扰。因此，我们选择在柱温为30℃时进行实验。

2.1.3 色谱条件优化

本试验中，也对流动相、色谱柱进行了选择。试验考察了乙腈-水比例分别为30∶70、20∶80、10∶90时，流动相体系对色谱图分离情况的影响。发现在乙腈-水比例为10∶90时，既缩短了试验的分析时间，又可以很好地保证分离度，如图1所示。

试验还考察了EC-C₁₈色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）、XDB-C₁₈色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、SB-C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）对3种化合物的分离效果。发现，EC-C₁₈色谱柱（4.6 mm×00 mm，2.7 μm）既可以保证化合物的峰型、分离度，又可以缩短分析时间，如图2所示。

2.2 标准曲线、线性范围及检出限

在优化后的试验条件下，配制0.10 mg/kg、1.00 mg/kg、10.00 mg/kg、100.00 mg/kg、200.00 mg/kg、300.00 mg/kg不同浓度的糠醛、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛混合标准溶液进行测定，图3为0.10 mg/kg浓度点的色谱图。

以峰面积（Y）为纵坐标，以待测物含量（X，mg/kg）为横坐标，绘制标准曲线。结果如下：5-羟甲基糠醛、糠醛、5-甲基糠醛在0.10～300.00 mg/kg范围内具有良好的线性，其线性方程分别为Y = 147.11X + 64.161，Y = 174.33X + 3.5535，Y = 121.12X – 6.7944；相关系数（r²）均大于0.999，分别为0.9998、0.9999和0.9997；检出限（S/N = 3）分别为24.6、38.3、51.5 μg/kg（表1）。

表1 线性范围、标准曲线回归方程、相关系数及检出限

Table 1 Standard curve of regression equation, correlation coefficient and linearity ranges

2.3 日内和日间精密度试验

对空白蜂蜜样品加入10.00 mg/kg的混标，按该试验方法处理后对该方法在仪器上的日内精密度与日间精密度进行考察。试验中，将处理后的样品重复进样10次，3种糠醛类物质的日内相对标准偏差RSD为0.1%～0.4%。将处理后的样品连续测定5 d，此3种物质的日间RSD为0.1%～0.5%。结果表明，该方法在仪器上具有良好的日内精密度与日间精密度。

2.4 回收率与相对标准偏差

取不含本底的蜂蜜样品18份，分别加入低、中、高3个浓度的糠醛类化合物混合标准溶液，按试验方法处理后进样，结果见表2。由表2可知：5-羟甲基糠醛、糠醛与5-甲基糠醛的加标回收率分别为94.0%～99.6%、94.1%～103.0%、92.4%～97.9%，RSD分别为1.5%～3.9%、1.3%～2.9%、1.9%～3.6%，说明该试验方法具有良好的准确度及精密度。

2.5 实际样品的测定

运用本研究建立的方法对15个蜂蜜样品进行检测，结果见表3。数据表明，12个蜂蜜样品检出目标物，其余蜂蜜样品均未检出。对于3种待测物质，5-羟甲基糠醛和糠醛的检出率分别为80%和73%，5-甲基糠醛均未检出。

表2 空白样品加标后的回收率（n =6）

Table 2 Recovery results of spiked blank sample (n = 6)

表3 蜂蜜样品的检测结果

Table 3 Results for determination of honey products

注: “—”表示未检出

2.6 加热过程与存放时间的影响

将5^#蜂蜜置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的恒温箱中，放置24 h后取出称样，测定其中糠醛类物质含量。根据数据得知：随着加热温度的提升，蜂蜜中5-羟甲基糠醛、糠醛的检测值由起初的缓慢增加变为快速增加。同时，将5^#蜂蜜样品在40℃的恒温环境下放置4个月，随后用本试验方法对该样品进行分析及测定，5-羟甲基糠醛、糠醛分别由18.41 mg/kg、1.92 mg/kg增加到24.63 mg/kg、2.19 mg/kg。通过分析试验数据，发现5^#蜂蜜样品中5-羟甲基糠醛和糠醛的含量均明显增加，分别为33.81%和14.29%，说明高温条件会影响蜂蜜产品的品质，所以要对蜂蜜产品在热加工处理过程中的温度进行控制，且要对存放环境的温度条件进行监控^[18-20]。

3 结论

本研究用高效液相色谱法对糠醛类物质进行测定。该方法可以同时测定蜂蜜中的5-羟甲基糠醛、糠醛、5-甲基糠醛，前处理操作简单、快速，回收率好，具有较好的准确度和精密度。同时，考察了温度变化、储存时间对糠醛类物质变化的影响。结果表明，在蜂蜜产品的热加工处理过程中要注意对温度的控制，且不要将产品在高温条件下长时间储存。建议广大消费者在购买蜂蜜产品后注意存放方式并及时饮用，以保证蜂蜜的食用安全性。

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2.174

2.759

2.334

图1 流动相组成对分离的影响

Fig.1 Resolutions with different mobile phase compositions

12.888

图2 色谱柱对分离的影响

Fig.2 Resolutions with different chromatographic columns

12.921

图3 5-羟甲基糠醛、糠醛、5-甲基糠醛色谱图（0.10 mg/kg）

Fig.3 Chromatograms of 5-hydroxymethylfurfural, furfural and 5-methylfurfural (0.10 mg/kg)