张海滨 王建华 殷其刚 肖妍 王禹 刘洋 吴冬雪 王乃福

摘 要 为建立一种快速检测赤狐皮毛的方法，试验根据赤狐皮毛线粒体COX3基因保守区设计了特异性引物和TaqMan探针，通过优化反应条件建立了一种检测赤狐皮毛的TaqMan探针荧光PCR检测方法。结果表明，该方法对赤狐皮毛具有特异性，不与兔皮毛、山羊皮毛、绵羊皮毛、貂皮毛和貉子皮毛发生交叉反应。该方法对质粒标准对照（PUC-VV-）的最适线性检测范围为4.8×10¹ ～4.8×10⁸ copies/μL，标准曲线方程为Y = -3.4752X + 40.118，相关系数（r²）为0.9897，检测下限为48 copies/μL。对3个不同浓度的pCR-GPTV-ITR进行组内试验和组间试验，每个浓度的重复试验Ct值的变异系数均小于1.5%，具有良好的重现性。采用该方法检测2份赤狐皮毛为阳性，其他10份动物皮毛样品为阴性。本方法的建立为赤狐皮毛检测提供了一种快速准确的技术手段。

关键词 赤狐皮毛；COX3基因；荧光PCR方法

Development of a TaqMan Probe Fluorescence PCR Assay for Detection of Red Fox Fur Based on COX 3 Gene

ZHANG Hai-Bin¹ WANG Jian-Hua¹ YIN Qi-Gang¹ XIAO Yan¹

WANG Yu¹ LIU Yang¹ WU Dong-Xue¹ WANG Nai-Fu^1*

Abstrct To rapidly detect red fox fur, we conducted an experiment to design specific primers and a TaqMan-MGB probe based on the conserved region of the red fox fur mitochondrial COX3 gene. Through optimizing reaction conditions, we developed a real-time PCR detection method for red fox fur. Results show that the assay is 100% specific for the red fox fur without cross-reactions with rabbit fur, goat fur, sheep fur, mink fur and raccoon fur. The optimal linear detection range for the plasmid standard control (PUC-VV-) is 4.8×10¹-4.8×10⁸ copies/μL, with a standard curve equation of Y = 3.4752X + 40.118, a correlation coefficient (r²) of 0.9897, and a detection limit of 48 copies/μL. The intra-assay and inter-assay tests were conducted for three different concentrations of pCR-GPTV-ITR. The coefficient of variation for repeated experiments at each concentration, as indicated by the Ct values, was consistently below1.5%, indicating excellent reproducibility. Application of this method for detecting two red fox fur samples yileded positive results while the other 10 animal fur samples tested negative. In conclusion, the development of this assay provides a rapid and accurate technical means for detecting red fox fur .

Keywords red fox fur; COX3 gene; real-time PCR

基金项目：天津海关科技计划项目（2022THK005）

第一作者：张海滨（1973—），男，汉族，山西榆次人，本科，高级工程师，主要从事动物及动物产品动物疫病检测方法研究工作，E-mail: 1046821794@qq.com

通信作者：王乃福（1981—），男，汉族，山东青岛人，硕士，高级工程师，主要从事动物及动物产品动物疫病检测方法研究工作，E-mail: wang22674317@163.com

1. 天津海关动植物与食品检测中心 天津 300000

1. Animal, Plant & Foodstuff Inspection Center of Tianjin Customs District, Tianjin 300000

赤狐（Vulpes vulpes）属食肉目犬科动物，现存47个亚种，遍布整个北半球，包含欧洲、北美洲、亚洲草原以及北非地区，在我国西藏、新疆、内蒙古、东北和云南等地区亦有分布^[1]。狐狸皮因色泽艳丽、板质柔韧和皮毛绒丰厚等优点，被誉为世界三大裘皮支柱之一，尤其是赤狐的一种体色变异类型——银狐更是狐皮中的珍品。近年来，过度的人为猎捕致使其野生数量急剧减少，野生赤狐皮愈显贵重。目前赤狐已被我国列入《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》^[2]，为国家二级保护动物，其中赤狐阿富汗亚种、赤狐白足亚种（赤狐旁遮普亚种）、赤狐西藏亚种被列入《华盛顿公约》保护动物。按照有关法律规定，个人非法购买、携带、邮寄濒危野生动植物及其制品进出境的，一旦被海关查获，由海关依照相关规定予以处罚，情节严重构成犯罪的将依法追究刑事责任。

目前对狐狸皮主要采用眼观、手触、点燃和镜检等手段加以鉴定，这种宏观观察法对检验人员的专业知识、专业背景和经验要求较高，检测结果的主观性很强、准确度因人而异^[3-6]。不同生物间具有相似结构及功能的蛋白质分子，其编码基因序列存在着一定的差异，这种差异可以作为鉴定动物皮毛种类的依据^[7-8]。为此，本研究以赤狐皮毛线粒体中的COX3基因为检测靶序列，设计特异引物和探针，建立了一种能够检测野生赤狐皮毛的TaqMan探针荧光PCR检测方法。

1 材料和方法

1.1 动物皮毛及其线粒体核酸提取

10份兔皮毛、山羊皮毛、绵羊皮毛、貂皮毛、貉子皮毛，在不损害动物条件下，采自国内动物饲养场，2份赤狐皮毛采自国内动物园，在进行动物皮毛DNA裂解之前，首先取30 mg动物皮毛用70%乙醇清洗1次，再用蒸馏水清洗2次，采用液氮研磨法将皮毛干研磨成粉末，然后称取5 mg置于2 mL的离心管中，采用一管式动物皮毛发DNA抽提试剂盒，按说明书提取动物皮毛线粒体DNA，-20℃条件下保存备用。

1.2 主要试剂与仪器

一管式动物皮毛发DNA抽提试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Premix Ex Taq™（Probe qPCR），购自宝日医生物技术（北京）有限公司。ABI QuantStudio5 pro荧光PCR仪，eppendoff centrifuge 5810R高速冷冻离心机。

1.3 阳性对照质粒的合成

含有赤狐线粒体COX3扩增靶基因序列的质粒标准对照，由生工生物工程（上海）股份有限公司构建，命名为PUC57-VV-COX3，用核酸测定仪测得的目的基因拷贝数为4.8×10⁹ copies/μL。

1.4 引物、探针的设计与合成

根据赤狐线粒体COX3基因序列（GenBank KT448287.1）的保守区域，用Beacon Designer 7.0软件设计特异性引物和TaqMan探针，预期扩增片段长度为102 bp，设计的引物和探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，探针5′端用FAM标记，3′端用BHQ1标记，经试验选取的引物和探针序列见表１。

表1 引物与探针序列

Table 1 Primer and probe sequences

1.5 荧光PCR反应条件的优化

采用Premix Ex Taq™（Probe qPCR）试剂进行荧光PCR反应条件的优化，反应体系为25 μL，以方阵试验筛选最适的引物浓度和探针浓度组合，然后在最适的引物和标记探针浓度组合条件下，筛选最适的退火延伸温度。

1.6 标准曲线的建立及敏感性试验

对标准阳性质粒PUC57-VV-COX3（4.8×10⁹ copies/μL）进行10倍系列稀释，选择4.8×10¹～4.8 ×10⁸ copies/μL浓度范围的质粒，按优化的反应条件进行荧光PCR扩增，在扩增结束后以Ct值为横坐标，以PUC57-VV-COX3模板起始拷贝数的对数为纵坐标，绘制定量标准曲线，并确定该方法的最低检测限。

1.6 特异性试验

应用优化的荧光PCR方法，对兔皮毛、山羊皮毛、绵羊皮毛、貂皮毛、貉子皮毛和赤狐皮毛的线粒体DNA样本进行检测，以确定该方法的特异性。

1.7 重复性试验

选取4.8×10⁴ copies/μL、4.8×10⁵ copies/μL、4.8×10⁶ copies/μL浓度的标准阳性质粒PUC57-VV-COX3为模板，按优化的荧光PCR方法进行组内试验与组间试验，每个样品做3个平行检测，以确定本方法的可重复性。

1.8 动物皮毛检测

对12份来自国内动物养殖场和动物园的兔皮毛、山羊皮毛、绵羊皮毛、貂皮毛、貉子皮毛和人工繁育的银狐皮毛和赤狐皮毛，首先用一管式动物皮毛发DNA抽提试剂盒按说明书提取线粒体DNA后，然后用本研究建立的方法进行检测。

2 结果

2.1 荧光PCR反应条件的优化

以4.8×10⁴ copies/μL浓度的标准阳性质粒PUC57-VV-COX3为模板，使用Premix Ex Taq™ （Probe qPCR）试剂，通过优化上、下游引物和探针的浓度及反应参数，确定TaqMan荧光PCR的最适反应体系为：2×Premix Ex Taq™（Probe qPCR）反应液12.5 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL，探针（2.5 pmol/μL）1.0 μL，模板1.0 μL，加ddH2O补足至25 μL，反应参数为：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40个循环。扩增曲线如图1所示。

图1 质粒标准对照PUC57-VV-COX3 (4.8×10⁶ copies/μL) 的荧光PCR动力学曲线

Fig.1 Fluorescence PCR kinetic curve of plasmid standard control PUC57-VV-COX3 (4.8×10⁶ copies/μL)

2.2 定量标准曲线及最低检出限

使用4.8×10¹～4.8×10⁸ copies/μL浓度范围的标准阳性质粒PUC57-VV-COX3，进行荧光PCR扩增，获得的扩增曲线和定量标准曲线见图2A和图2B。以Ct值为横坐标、PUC57-VV-COX3模板起始拷贝数浓度的对数为纵坐标，绘制的定量标准曲线为Y = -3.4752X + 40.118，相关系数（r²）为0.9897，该荧光PCR方法最低可检出48 copies/μL浓度的标准阳性质粒PUC57-VV-COX3。

2.3 特异性试验

应用建立的荧光PCR方法检测的野生赤狐皮毛线粒体核酸样本，呈现典型的扩增曲线，而对兔皮毛、山羊皮毛、绵羊皮毛、貂皮毛和貉子皮毛的线粒体核酸样本则无扩增曲线出现，表明本研究建立的荧光PCR方法检测野生赤狐皮毛具有良好的特异性（图3）。

2.4 重复性试验

检测结果见表2，3个浓度的标准阳性质粒的组内试验与组间试验Ct值的变异系数均小于1.5%，表明本试验所建立的荧光PCR检测体系稳定，具有良好的重复性。

a: 质粒标准对照PUC57-VV- COX 3 (10 ⁶ copies/ μ L); b: 兔皮毛、山羊皮毛、绵羊皮毛、

貂皮毛、貉子皮毛和人工繁育的银狐皮毛的线粒体核酸样本

图3 荧光PCR特异性试验结果

Fig.3 Results of fluorescence PCR specificity test

2.5 动物皮毛样本检测

对来自国内养殖场和动物园的12份兔皮毛、山羊皮毛、绵羊皮毛、貂皮毛和貉子皮毛样本，采用本研究建立的荧光PCR方法进行检测，结果显示2份赤狐皮毛的线粒体核酸为阳性，其他10份动物皮毛的线粒体核酸样品为阴性，表明本研究建立的荧光PCR方法可以快速、敏感地检测野生赤狐皮毛。

3 结论

对狐狸皮毛种类的鉴定，目前主要根据狐狸皮毛的大小、皮板厚度、皮毛密度、皮毛长度，皮毛的平齐度、灵活度、润滑度以及尾长与体长的比例等加以鉴别^[9]，但这种宏观观察法对检验人员的专业知识和实际经验要求较高，检测结果的主观性很强，准确度因人而异。 此外，采用哈式切片法结合光学显微镜观察动物皮毛及绒皮毛表面特征和横断面的微观结构，以及利用电子显微镜对皮毛髓形态、排列和鳞片特征的观察，也可作为鉴定狐狸皮毛的重要依据^[10-12]，但对于形态结构类似的皮毛种类，采用显微观察法亦不能准确判别。

研究发现，在动物皮毛发中核DNA含量较低，而线粒体DNA比核DNA的拷贝数要高很多，线粒体DNA D-loop区、COⅠ基因、Cytb基因以及16S DNA基因在物种间变大，种内相对保守，具有很高物种特异性，适合于遗传多样性、种属鉴定和亲缘关系的研究^[13-15]，近年来采用PCR或荧光PCR方法鉴定动物皮毛种类的研究已有报道。顾文佳等^[16]基于水貂Cytb基因序列设计特异性引物和探针，建立了用于鉴定水貂毛皮荧光PCR方法，可作为宏观法的有效补充和验证。费静等^[17]通过设计针对兔、狐线粒体12S rRNA基因的特异性TaqMan探针和引物对，建立了基于DNA分析的兔毛纤维和狐狸毛纤维鉴别方法，与传统的显微镜法结合使用，可以有效鉴别织物中含有的微量兔毛、狐狸毛纤维。刘艳艳等^[18]根据８种动物16S rDNA基因特异核苷酸序列设计通用PCR引物和特异性TaqMan探针，建立了多重实时荧光 PCR检测体系，可用于水貂、狐狸、骆驼、兔、山羊、绵羊、鸭和鹅８种动物及其混合物毛纤维的鉴定。本研究根据赤狐皮毛线粒体COX3基因保守区设计了特异性引物和TaqMan探针，通过优化反应条件建立了一种检测赤狐皮毛的TaqMan探针荧光PCR检测方法，试验结果表明该方法对赤狐皮毛具有特异性、敏感性和重现性。本方法为野生赤狐的鉴定和海关查验非法携带的赤狐皮毛的鉴定提供了一种快速、准确的技术手段。

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A

图2 质粒标准对照PUC57-VV-COX3（4.8×10¹ ～4.8×10⁸ copies/μL）的荧光PCR扩增曲线（A）和标准曲线（B）

Fig.2 Fluorescence PCR amplification curve (A) and standard curve (B) of plasmid standard control (4.8×10¹ ～4.8×10⁸ copies/μL)

表2 TaqMan探针荧光PCR重复性试验结果

Table 2 Results of TaqMan probe fluorescence PCR repeatability test