田纯见 刘建利 梅明珠 王莹 丁宁 鱼海琼 李群辉

摘 要 核酸扩增技术是一种在生物技术领域广泛使用的技术，可通过特定的方法将DNA或RNA片段扩增至百万倍甚至更高倍数，从而检测和识别这些片段。核酸扩增技术包括多种方法，如实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、数字PCR技术（digital PCR，dPCR）、重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）等。在动物检疫方面，通过对动物体内特定病原体的核酸进行扩增，可以快速、准确地检测出该病原体，并采取相应的防控措施；通过对动物源性食品中的病原微生物进行核酸扩增，可以检测出食品中的细菌、病毒等有害物质，保证食品的安全性。随着技术的发展，核酸扩增技术将更加自动化、高通量和快速，灵敏度和特异性将进一步提高。随着微流控技术和纳米技术的发展，核酸扩增技术将变得更加便携，与人工智能、大数据等技术结合，实现智能化和信息化检测，多学科交叉将成为核酸扩增技术发展的重要趋势，有助于推动该技术的创新和应用。

关键词 实时荧光定量PCR；数字PCR；环介导等温扩增；重组酶聚合酶扩增；动物检疫

Application, Challenges and Countermeasures of Nucleic Acid Amplification Technology in Animal Quarantine

TIAN Chun-Jian¹ LIU Jian-Li² MEI Ming-Zhu¹ WANG Ying¹

DING Ning¹ YU Hai-Qiong¹ LI Qun-Hui³

Abstract Nucleic acid amplification technology is a widely used technique in the field of biotechnology, which amplifies DNA or RNA fragments to million-fold or even higher folds through specific methods, allowing these fragments to be tested and identified. Nucleic acid amplification technology includes various methods, such as quantitative real-time PCR (qPCR), digital PCR (dPCR), recombinase polymerase amplification (RPA), etc. In animal quarantine, by amplifying nucleic acids of specific pathogens in animals, the pathogen can be quickly and accurately detected, and corresponding prevention and control measures can be taken. Through nucleic acid amplification of pathogenic microorganisms in animal-derived food, harmful substances such as bacteria and viruses in food can be detected to ensure food safety. With the development of technology, nucleic acid amplification technology will become more automated, high-throughput and fast, and the sensitivity and specificity will be further improved. With the development of microfluidic technology and nanotechnology, combined with artificial intelligence, big data and other technologies, nucleic acid amplification technology will become more portable, to achieve intelligent and information-based detection. Multidisciplinary intersection will become an important trend in the development of nucleic acid amplification technology, which will promote the innovation and application of this technology.

Keywords quantitative real-time PCR; digital PCR; loop-mediated isothermal amplification; recombinase polymerase amplification; animal quarantine

基金项目：广东省标准化战略资金项目（KYHZ2022B02，KYHZ2023B15）

第一作者：田纯见（1965—），男，湖北长阳人，博士，研究员，主要从事动物检疫研究工作，E-mail: gzvettian@163.com

1. 广州海关技术中心 广州 510623

2. 深圳海关动植物检验检疫技术中心 深圳 518045

3. 广东省温氏集团研究院 云浮 527300

1. Guangzhou Customs Technology Center, Guangzhou 510623

2. Shenzhen Customs Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center, Shenzhen 518045

3. Guangdong Wenshi Group Research Institute,Yunfu 527300

核酸扩增技术是一种体外酶促合成特异DNA片段的检测方法。相较于传统的培养方法和免疫学检测方法，核酸扩增技术具有更高的灵敏度和特异性，能够更准确地检测出动物体内的病原体。核酸扩增技术，如PCR技术，已被广泛应用于动物病原体的快速检测和鉴定，还可以用于动物疫病的流行病学调查，通过对不同地区、不同种类的动物进行病原体的检测，可以了解病原体的分布和传播情况，为疾病的预防和控制提供参考。

目前，核酸扩增技术在动物检疫领域发挥了重要作用，为口岸动物检疫工作提供了有力支持。然而，核酸扩增技术种类繁多，具体选择和应用要根据实际情况和需求进行。随着病原体的不断变异和进化，我们需要不断改进和完善核酸扩增技术，以应对新的挑战。

1 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是最经典的核酸扩增技术，通过热变性、复性及延伸等步骤使DNA在体外进行指数级扩增。随着分子生物学技术的发展，PCR技术逐渐衍生出侧重于不同实验目的及应用的核酸扩增技术。

1.1 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是在普通PCR技术定性基础上发展而来的核酸定量检测技术。qPCR技术在核酸扩增反应中加入了荧光染料或荧光标记的特异性探针，在扩增过程中，每经过一次循环，报告基团发射的荧光信号无法被淬灭基团吸收，荧光检测系统可接收并记录荧光信号，随着反应的持续进行，荧光信号强度相应增加，通过监测接收的荧光化学信号可以对PCR反应循环后的产物总量进行定量。在PCR扩增的指数时期，扩增产物与荧光信号的累积完全同步，模板的Ct值和起始拷贝数存在线性关系，从而实现对核酸的定量分析和实时监测。

该技术通过对荧光信号的实时检测，与普通的PCR技术相比，具有更高的灵敏度、可靠性和特异性。qPCR通常使用内参或外参法对待测样品中的某一特定核酸序列进行定量分析。内参法是使用管家基因作为内参，对待测样品中的未知量和参照物进行同时测定。外参法则是用已知拷贝数的标准品作为参照物，对待测样品中的未知量进行定量分析。

在动物检疫领域，qPCR技术发挥了重要作用，其可以在短时间内快速检测出动物体内的病毒、细菌、寄生虫等病原体，大大缩短了检测时间。qPCR技术具有极高的灵敏度，可以检测出动物体内微量的病原体，有效预防疾病的传播。同时，较高的特异性可准确区分不同的病原体，避免误判和漏检。qPCR技术在动物检疫领域的应用范围非常广，可以用于检测多种不同类型的动物和病原体，为动物疫病的预防和控制提供了有力支持。康台生等^[1]建立了一种三重一步法qPCR方法，能够快速检测3种牛病毒（BCoV、BEV、BVDV），该方法的最低检测限为10 copies/μL，批内和批间的变异系数（CV）均在2%以下。此外，这种方法对常见腹泻类病原没有交叉反应。他们使用这种方法检测了河南省445份牛腹泻粪便样本，3种病毒的阳性检出率分别为6.5%、17.5%和12.1%。陈超等^[2]建立了一种快速、敏感的猪丹毒丝菌SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法。该方法对质粒标准品的最低检测浓度为20 copies/μL，灵敏性比普通PCR提高了1000倍。此外，这种方法对猪源细菌不发生交叉反应，该研究进一步对20个疑似猪丹毒丝菌临床样品进行检测，阳性检出率为60%，优于普通PCR的检出率。

这些研究展示了qPCR技术在动物检疫中的重要应用，包括提高检测的灵敏度和特异性，降低检测限，以及更准确地鉴定和分类病毒和细菌。目前，qPCR技术在动物检疫领域的应用已经取得了显著的进展。未来，随着技术的不断进步和应用范围的扩大，qPCR技术将会在动物检疫领域发挥更加重要的作用，为保障动物健康和食品安全作出更大贡献。

1.2 数字PCR

数字PCR技术（digital PCR，dPCR）是一种核酸分子绝对定量技术，包括PCR扩增和荧光信号分析两部分。进行扩增前，将稀释后的PCR溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，将其稀释分离成单分子，随后再各自进行PCR扩增。扩增结束后收集每个反应器的荧光信号，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号；反之，没有模板的反应器则没有荧光信号。根据反应器的荧光信号相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度或含量。该检测方法灵敏度高、特异性强，多应用于致病菌、病毒、基因突变、细胞及基因治疗和甲基化DNA的检测等领域。

dPCR技术在动物检疫中逐渐得到研究和应用。李丹等^[3]建立了同时检测H7亚型和N2亚型禽流感病毒的双重纳米dPCR方法，其他亚型禽流感病毒及常见禽类呼吸道病毒均未出现特异性条带，H7亚型AIV和N2亚型AIV的最低核酸检测量均达到了5×10³ copies/μL，其敏感性是普通双重PCR检测方法的10倍，其对临床样品检测结果的准确率达到100%，可以用于禽流感临床样品鉴别诊断和日常防控监测。F Meng等^[4]建立了检测疫苗中REV污染的dPCR方法，可以有效地对低剂量REV污染进行定量检测。

1.3 连接酶链反应

连接酶链反应（ligase chain reaction，LCR）是一种新型的DNA体外扩增和检测技术。LCR的基本原理是利用DNA连接酶将某一DNA链的5-磷酸与另一相邻链上的3-羟基连接，从而利用两对互补的寡核苷酸序列将靶DNA序列特异性地连接起来，形成新的DNA链。LCR多用于基因突变的研究检测、微生物种型鉴定及定向诱变等领域。傅光华等^[5]使用LCR技术建立了不同禽源中坦布苏病毒分离株的快速检测方法，其检测结果与常规RT-PCR检测的敏感性相当，140份临床样品检出率为14.3%。

2 等温扩增技术

等温扩增技术（isothermal amplification techno- logy，IAT）是近年来迅速发展的一类核酸体外扩增技术。与PCR技术不同，等温扩增技术只需要利用水浴锅等常用控温设备在单一恒定的温度下（一般是60～65℃恒温进行）就能快速完成核酸扩增反应，通过比色/目视比浊法直接观察扩增结果。IAT具有特异性强、灵敏度高、简单便捷和成本低等优点，且降低了对设备的要求，缩短了检测时间，可实现即时检测，已被应用于体外诊断领域，如沙门氏菌核酸扩增检测试剂盒、非洲猪瘟核酸扩增检测试剂盒等，今后也可能在传染病诊断、动物疫病分子诊断、环境微生物检测等领域大规模使用。

2.1 环介导等温扩增

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是利用DNA在等温（60～65℃）动态平衡条件下，设计4条特异性引物来识别靶基因的6个特定区域，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行延伸，得到双链扩增产物的技术。其引物设计巧妙，使用一对外部引物和一对内部引物，可以识别目的序列上6个不同的区域，对目的序列具有特异性，减少了非靶标序列的影响。其产物检测方法多样，所产生的阳性扩增反应产物为类似花椰菜结构的沉淀物，可用凝胶电泳、肉眼、染料或浊度仪进行检测。浊度仪是根据扩增产物混浊度的差异，实现对原始核酸分子进行实时定量分析。

LAMP技术广泛应用于各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测和食品化妆品安全检测。在动物检疫领域，LAMP技术可用于检测各种动物疫病，如禽流感病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒等的检测，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强等优点。此外，LAMP技术还可以结合其他技术，如基因芯片技术等，进一步提高检测的准确性和效率。例如，杜鹃等^[6]建立了弓形虫LAMP荧光检测方法，灵敏度为1 copy/μL，与其他寄生虫无交叉反应，检测200份临床样品结果与qPCR检测结果一致。田万年等^[7]建立了快速简便的羊泰勒虫LAMP检测方法，利用该方法分别检测羊泰勒虫、瑟氏泰勒虫、卵形巴贝斯虫、附红细胞体的DNA，检测结果显示羊泰勒虫呈阳性，其他虫体均为阴性，表现出较好的特异性，对羊泰勒虫DNA最低检测量为1.9×10^-9 ng/μL，是PCR方法的100倍，利用LAMP、PCR检测疑似羊泰勒虫感染病例，阳性检出率分别为20%和16.67%。

目前，LAMP技术在动物检疫中的应用已经得到了广泛认可。国内外许多动物卫生监督机构和实验室都已经采用了LAMP技术进行动物疫病的检测和诊断。同时，随着技术的不断发展和完善，LAMP技术在动物检疫中的应用前景将更加广阔。

2.2 重组酶聚合酶扩增

重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polyme rase amplification，RPA）是一种在恒温条件下（37～42℃）进行的核酸扩增方法，通过重组酶、聚合酶、多个具有特异性的引物和模板DNA相互作用，寻找同源序列实现核酸的扩增。RPA技术是一种完全不同于常规PCR扩增技术的非特异性、非催化性的扩增技术，无需经过DNA解链过程就能启动DNA复制。RPA技术只需10～30 min即可完成整个扩增反应，可以在短时间内完成DNA分子的指数式扩增。RPA技术使用特异性的引物和重组酶可以在扩增过程中准确地识别目标DNA序列，避免了假阳性等问题的出现。RPA技术可以检测出痕量DNA，灵敏度比传统PCR方法更高。RPA技术使用非变性聚合物作为反应介质，可以有效保护扩增产物免受污染，提高实验的安全性，可广泛应用于细菌、病毒、真菌等病原体的检测和动物疫病检测等领域，为其提供可靠的检测方法和支持。

近期，RPA技术已经成为动物检疫领域的研究热点。例如，邓俊花等^[8]建立了非洲猪瘟病毒（ASFV）的RPA检测技术，在15 min内即可完成检测，最低检测限为10 copies/μL，且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等均无交叉反应。利用所建立的方法对266份临床样品进行检测，结果与世界动物卫生组织（WOAH）推荐的荧光PCR检测方法的符合率为100%，所建立的基因缺失株的荧光RPA检测方法适配可移动式检测仪，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强的优点，适用于非洲猪瘟现场快速临床检测，为非洲猪瘟疫情防控提供了一种新的筛查手段。豆玲等^[9]建立了绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA检测方法，结果显示该方法仅对羊痘疫苗、羊痘重组质粒、绵羊痘病毒核酸和山羊痘病毒核酸阳性样品显示出阳性检出。刘孟啸等^[10]建立了鸭腺病毒3型荧光RPA恒温快速检测方法，结果显示最佳反应条件为38℃、18 min，与其他常见鸭病病原无交叉反应，对重组质粒最低检测限为1 copy/μL。采用建立的RPA检测方法和qPCR对55份鸭组织临床样本进行检测，阳性率分别为65.4%、50.9%，检测符合率为92.7%。袁嘉康等^[11]建立了猪流行性腹泻病毒RPA与侧流层析试纸技术相结合的快速检测方法，40.8℃恒温反应21 min即可完成检测，最低检测限为127 copies/μL，且与其他猪病毒无交叉反应，临床样本检测与RT-PCR检测结果完全一致。早期，Meishen Ren等^[12]建立了ASFV RPA-CRISPR的核酸扩增检测方法，具有与传统qPCR方法相同甚至更高的灵敏度，可将ASFV基因组DNA与其他猪病毒的DNA/RNA区分开来。

2.3 核酸依赖性扩增

核酸依赖性扩增检测技术（nuclear acid sequence-based amplification，NASBA）是利用3种引物和逆转录酶、RNA聚合酶进行扩增，可对扩增结果进行实时监测的技术。该技术在42℃恒温下进行，整个反应过程由3种酶（反转录酶、核糖核酸酶H和噬菌体T7 RNA聚合酶）控制，模板RNA可以在2 h左右扩增到10⁹～10¹²倍，无需特殊的仪器设备。

NASBA技术可用于动物病原检测，能够快速、准确地检测出动物体内的病原微生物，如病毒、细菌、寄生虫等。例如，研究人员利用NASBA技术成功地检测出了猪瘟病毒、禽流感病毒、口蹄疫病毒等动物疫病病原，为及时诊断和治疗提供了有力支持。董航等^[13]建立了鸭病毒性肝炎的NASBA检测方法，结果表明该方法具有特异性、敏感性和可重复性。此外，NASBA技术还可以与其他技术结合使用，如qPCR技术、基因芯片技术等，进一步提高检测的准确性和效率。杨平东等^[14]建立了猪瘟病毒的NASBA和RT-LAMP两步法检测技术，灵敏度与巢式RT-PCR相当，最低能检测出46 pg/μL的病毒RNA。

2.4 解链酶扩增

解链酶扩增技术（delicase-dependent amplifica tion，HDA）是以解链酶催化的恒温核酸扩增方法，其基本过程包括模板预处理，核心酶的组装、激活、起始和延伸等步骤。与其他等温扩增技术类似，其优点在于特异性更高，对模板的起始量要求较低，且在短时间内能够获得较高的扩增效率，以及能在短时间内将特定的DNA片段扩增数百万倍。同时，HDA技术对仪器的要求较低，可以在普通PCR仪或者水浴锅中进行操作，因此也更容易推广应用。目前，HDA技术在多个领域得到广泛应用，如临床诊断、环境监测、食品安全和动物疫病检测等。王建广等^[15]建立了单核细胞增生李斯特氏菌的HDA检测方法，最低检测限为7.8×10³ cfu/mL，灵敏度与普通PCR方法相当。金静维等^[16]建立了口蹄疫病毒RT-HDA快速检测方法，可检测到0.2 ng/μL的FMDV核酸量，比普通RT-PCR高10倍，与其他猪病毒无交叉反应。

2.5 链置换扩增

链置换扩增技术（strand displacement amplifica- tion，SDA）是基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术，利用限制性内切酶来识别序列，在单链DNA模板上进行的等温扩增。采用标记两种不同荧光基团的探针，扩增过程中，探针被掺入到双链DNA产物中，限制内切酶的酶切作用使淬灭基团与荧光基团分开，从而释放荧光信号，用荧光偏振检测荧光法定量检测。无需温度循环，在单一管中进行等温扩增。产物中不含有引物序列，因此可以省去引物去除的步骤。还可以检测模板链中单个碱基的突变。SDA技术主要应用在病原微生物检测、食品安全检测、法医鉴定或基因突变等方面。尼秀媚等^[17]建立了肠炎沙门氏菌的SDA快速检测方法，检测灵敏度达到7.0×10³ cfu/mL，且特异性良好。邓世琼等^[18]建立了SDA技术，可以检测到2 pmol/L的质粒DNA，扩增反应在15～30 min即可完成。

2.6 滚环核酸扩增

滚环核酸扩增技术（rolling circle amplification，RCA）是以环状DNA或RNA作为模板，以核苷酸为原料，使用一种具有链置换活性的DNA聚合酶和2对引物进行核酸扩增。RCA反应可以在23～60°C的低温下进行，在滚环机制下由单个DNA分子快速合成大量拷贝的DNA序列。引物与模板的3'端互补配对，然后DNA聚合酶从引导引物开始沿着模板链进行延伸。当新合成的链达到模板的另一侧时，会形成一个新的环状DNA分子，这个过程被称为滚环扩增。接着，新形成的环状DNA分子被线性化，再进行下一轮的合成。该技术主要用于基因组分析、基因克隆、基因诊断、基因组测序和基因芯片等领域。此外，结合不同的报告基因标记，该技术可用于基因表达、分子生物学和表型分析等方面的研究，还可以与基因芯片技术、生物传感器等结合使用，进一步提高检测的准确性和效率。

RCA技术可用于动物和动物产品的病原检测。陈国梁等^[19]建立了家兔豆状囊尾蚴感染的RCA检测方法，豆状囊尾蚴感染后不同时间的家兔血清miRNA检测结果显示，20份感染前的血清中19份检测结果为阴性，1份为阳性；感染后1个月的血清中，17份为阳性，2份为疑似阳性，1份为阴性；感染后2个月的血清，1份为阴性，其余为阳性；感染后3个月的血清，3份为阴性，其余为阳性。

3 总结与展望

核酸扩增技术具有较高的灵敏度，能够检测出动物体内微量的病原微生物。在感染的早期阶段，由于病毒或细菌的数量较少，传统检测方法可能难以检出，而进行核酸扩增后即可识别出极低浓度的病原，有助于及时发现并控制疾病传播。其次，核酸扩增技术较高的特异性可以准确检出特定的病原微生物。该技术通过特定的引物扩增病原微生物的核酸片段，避免可能出现的假阳性或假阴性结果，提高了动物检疫的准确性和可靠性。此外，核酸扩增可以检测多种病原微生物，如病毒、细菌和寄生虫等，能够满足不同动物种类和不同病原微生物的检测需求，在动物检疫中具有更广泛的应用。同时，核酸扩增也符合国内外贸易和法规要求。对于进出口贸易企业而言，可通过核酸扩增及时了解进出口产品的质量状况，确保产品符合相关标准和规定，保障贸易的顺利进行。

总之，核酸扩增技术在动物疫病诊断中发挥了重要作用，有助于促进畜牧业和渔业发展，维护国门生物安全，且随着技术的不断进步和应用范围的扩大，核酸扩增技术将在动物检疫领域具有更广泛的应用前景。

3.1 问题与挑战

3.1.1 核酸扩增技术的准确性

核酸扩增技术在动物检疫中的准确性可能会受到多种因素的影响。1）样本质量。采集样本不具有代表性，或样本在运输、保存过程中受到污染，可能导致检测结果不准确。例如，禽类喉泄拭子样本中病毒浓度过低可能会造成假阴性结果。2）引物特异性。核酸扩增依赖于特定的引物来扩增目标核酸片段，如果引物与目标核酸序列不完全匹配，可能导致假阳性或假阴性结果。因此，引物的选择和设计对于提高核酸扩增的准确性至关重要。3）交叉污染。在核酸扩增过程中，如果实验室内的环境或仪器受到污染，或者样本间的交叉污染，可能导致假阳性结果的产生。因此，实验室的清洁和消毒工作以及严格的实验操作规程是确保核酸扩增准确性的重要措施。4）操作误差。在核酸扩增过程中，操作人员技术不熟练或者操作不当可能会影响检测结果的准确性。例如，提取核酸时未能充分去除杂质，或者扩增反应过程中温度控制不当等，都可能导致检测结果不准确。5）试剂质量。试剂质量不佳或过期，可能会导致假阳性或假阴性结果。因此，选择高质量的试剂并确保试剂在有效期内使用是保证核酸扩增准确性的关键。

3.1.2 核酸扩增成本

核酸扩增技术在动物检疫中的成本相对较高，主要有以下几个方面的原因：1）仪器设备成本。核酸扩增技术需要使用特定的仪器设备，如荧光定量PCR仪、核酸提取仪等，这些设备通常价格较高，需要投入大量资金，且设备维护和校准也需要一定成本。2）试剂成本。核酸扩增所需的试剂包括引物、探针、酶等，通常需要定制或进口，价格较为昂贵。此外，由于核酸扩增需要多次重复实验，因此试剂消耗量也较大。3）样本处理成本。在核酸扩增中，样本的处理和前处理过程也是成本较高的环节，包括样本的采集、保存、运输、核酸提取等步骤，需要专业人员操作，并需要使用特定的设备和试剂，因此成本较高。4）人力成本。核酸扩增需要专业人员进行操作和解读结果，这些人员需要经过专业的培训和认证，因此人力成本较高。此外，由于核酸扩增的复杂性，实验室的运营和管理也需要投入大量的人力资源。

3.1.3 核酸扩增的标准化程度

核酸扩增技术在动物检疫的不同样品类型和动物的检测标准化方面面临的挑战，主要表现在以下几个方面：1）样品类型多样，标准化程度不一。动物检疫中涉及的样品类型多种多样，包括血液、组织、排泄物等，不同样品中病毒或病原体的含量和分布存在差异，因此标准化程度不一，这可能导致在某些样品中检测结果的准确性受到影响，从而影响对动物疫病的诊断和防控。2）不同动物种类间的检测标准化有待完善。不同动物种类在生理、免疫和疾病易感性等方面存在差异，因此对同一病原体的检测方法可能需要调整。然而，目前针对不同动物种类的核酸扩增标准化程度还需完善，在一定程度上可能导致检测结果存在偏差。3）检测方法的标准化需进一步规范。在核酸扩增过程中，从样本采集、处理、提取到扩增和结果判读等步骤需要遵循一定的操作规范和标准，目前针对不同动物疫病的核酸扩增方法尚未完全标准化，可能导致检测结果的可靠性受到影响。

3.2 对策建议

动物检疫是防控动物疫情扩散、保障公共卫生安全的重要措施。核酸扩增技术以其高灵敏度和特异性，在动物检疫领域中得到了广泛应用的同时，也面临一些问题与挑战，需要采取有效的应对措施。

首先，优化采样方案并严格处理样品。根据不同动物种类和疫情特点，制定科学的采样方案，确保采集的样品具有代表性，能够真实反映动物的健康状况。在采集的样品运输及处理过程中，应采取措施防止样品受到污染。同时，应确保实验室的生物安全，防止病毒的泄漏和传播。

其次，选择合适的核酸扩增方法并规范操作流程至关重要。根据检测目标病原的特点选择适合的核酸扩增方法。例如，qPCR是一种常用的核酸扩增技术，能够实现快速、准确地检测。还应建立完善的操作流程，确保检测过程的规范化和标准化，包括样品处理、核酸提取、扩增反应和结果判读等步骤。

第三，加强实验室能力建设和人员培训不容忽视。应提高实验室的核酸扩增技术水平和设备配置，确保检测结果的准确性和可靠性。同时，加强实验室的质量管理，确保检测过程的质量控制。对检测人员进行培训，提高其核酸扩增技术专业素养和技术水平，并通过定期培训、交流学习等方式，使检测人员熟练掌握核酸扩增技术及其在动物检疫中的应用方法。

最后，完善法律法规体系并加强国际合作与交流十分必要。进一步完善相关法律法规，以及进一步明确动物检疫的技术标准和操作规范。加强执法力度，对违反法律法规的行为进行严厉打击。此外，积极参与国际动物检疫和疫情防控合作，学习借鉴国际先进的核酸扩增技术和经验，并加强与周边国家的合作与交流，共同维护区域动物卫生安全。

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