张伟 朱万燕 李宁 高强

摘 要 本文通过优化不同蔬菜提取净化过程中加水量和净化剂用量，使用高效液相色谱串联质谱多反应监控模式，建立了优化QuEChERS结合高效液相色谱串联质谱仪测定不同种类蔬菜中21种农药残留的方法，方法检出限为0.5～1.55 μg/kg，相对标准偏差为1.8%～7.5%。结果表明，该方法灵敏度高﹑回收率稳定﹑重现性较好，适用于不同种类蔬菜中多种农药残留的快速检测。

关键词 蔬菜；农药残留；含水量；色素；QuEChERS方法

Determination of 21 Pesticide Residues in Different Types of Vegetables by Optimized QuEChERS Method

ZHANG Wei¹ ZHU Wan-Yan² LI Ning¹ GAO Qiang¹

Abstract In this paper, by optimizing the amount of water and purifying agent in the extraction and purification process of different vegetables, and using the multi-reaction monitoring mode of high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, an optimized method for the determination of 21 pesticide residues in different types of vegetables was established, with the detection limit of the method being 0.5-1.55 μg/kg and the relative standard deviation of 1.8%-7.5%. The results showed that the method had high sensitivity, stable recovery and good reproducibility, and was suitable for the rapid detection of a variety of pesticide residues in different types of vegetables.

Keywords vegetables; pesticides residues; water content; pigment; QuEChERS method

近年来，伴随着液相色谱-串联质谱仪及气相色谱-串联质谱仪等高精密度分析仪器在常规分析实验室的广泛使用，食品中农药残留提取净化处理方法向着快速、简便、高效的方向发展^[1-7]。2008年，欧洲标准化委员会下属技术委员会发布标准EN 15662:2008，使用QuEChERS方法对植物源性食品进行提取净化前处理，对不同植物源性食品前处理过程进行了较为详细的说明，2018年该标准进行了更新。我国于2018年和2021年相继发布了食品安全国家标准GB 23200.113—2018《植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》和GB 23200.121—2021《植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱联用法》，用于植物源性食品中农药残留的检测，分别使用的是气相色谱串联质谱仪（GC-MS/MS）和液相色谱串联质谱仪（LC-MS/MS）。以上两项标准提高了植物源性食品中农残检测效率，较好地满足了绝大多数植物源性食品农残快速检测需求，但是仍有需进一步明确的地方。GB 23200.113—2018中7.1.1将蔬菜﹑水果和食用菌采用同样的处理方法，未考虑不同蔬菜﹑水果和食用菌的含水量情况，也未能充分考虑不同蔬菜﹑水果和食用菌的色素水平，仅对颜色较深的添加GCB，而未对颜色深浅的蔬菜﹑水果和食用菌进行归类说明。GB 23200.121—2021对干制蔬菜﹑水果和食用菌加水量进行了笼统的说明，但是未对新鲜蔬菜﹑水果和食用菌加水量情况进行说明，未对颜色深浅的蔬菜、水果和食用菌进行归类说明。因此，在实际操作过程中，遇到具体的含水量较少或是一定色素水平的植物源性食品，标准由于缺乏一定的指导性，会造成检测结果存在一定的不确定性。

本文以几种常见的含水量﹑色素水平﹑基质复杂程度不同的蔬菜为代表性实验样品，以国家食品安全监控计划中对蔬菜常检的21种农药为检测项目，通过分析QuEChERS前处理过程中加水量以及净化剂用量对不同种类蔬菜中农残检测的影响，建立了优化QuEChERS前处理结合高效液相色谱串联质谱仪测定不同种类蔬菜中农药残留快速检测方法，以期为从事不同种类植物源性食品中农药残留检测技术人员提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260-6460液相色谱串联质谱仪（安捷伦科技）；Milli-Q Advantage A10超纯水系统（美国Millipore公司）；ST16R高速冷冻离心机（美国赛默飞科技）；GM300刀式混合研磨仪（德国莱驰）。

甲酸（色谱纯，美国 Fisher公司）；乙腈（色谱纯，德国CNW公司）；乙二胺-丙基硅烷化硅胶（PSA）（天津Agela公司）；石墨化炭黑（GCB）（天津Agela公司）；十八烷基硅烷键合硅胶（C18）（天津Agela公司）；柠檬酸钠二水合物（分析纯，天津光复公司）；柠檬酸钠倍半水合物（分析纯，天津光复公司）；无水硫酸镁（分析纯，天津光复公司）；氯化钠（分析纯，天津光复公司）。

流动相A：甲酸铵水溶液（c = 5 mmol/L），称取0.3153 g甲酸铵，用水溶解并定容至1000 mL，摇匀。流动相B：甲酸铵-乙腈溶液（c = 5 mmol/L），称取0.3153 g甲酸铵，用乙腈溶解定容至1000 mL，摇匀。

多菌灵﹑灭多威﹑噻虫嗪﹑噻虫胺﹑吡虫啉﹑啶虫脒﹑抑霉唑﹑克百威﹑甲霜灵﹑烯酰吗啉﹑嘧菌酯﹑灭线磷﹑氟硅唑﹑禾草敌﹑三唑磷﹑稻瘟灵、苯醚甲环唑﹑噁唑菌酮﹑硫线磷﹑辛硫磷﹑茚虫威（100 μg/mL，农业农村部环境保护科研监测所）。

山药﹑葱﹑姜﹑土豆﹑菠菜﹑芹菜等蔬菜来自本地抽检菜市场。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备与提取

依据GB 2763—2021中表A.1“食品类别及测定部位”对菠菜﹑芹菜﹑葱等洗净去除根部后匀浆混匀，对土豆﹑山药﹑姜等洗净后进行匀浆。样品制备过程中避免蔬菜汁的流失。对含水量＞80%的芹菜﹑葱﹑菠菜分别称取（10±0.1）g均质样品于50 mL离心管中；对于含水量在80%～40%之间的土豆和山药分别称取（10±0.1）g均质样品于50 mL离心管中，然后分别添加2.5 mL的水，涡旋30 s使充分湿润；对于含水量在80%～40%之间的姜称取（5±0.05）g均质样品于50 mL离心管中，加入6 mL水，涡旋30 s使充分湿润，以上6种蔬菜均按照以下操作：加入10 mL乙腈，拧紧离心管剧烈震荡1 min。将已经提前制备好的缓冲盐（4±0.2） g无水硫酸镁﹑（1±0.05）g氯化钠﹑（1±0.05）g柠檬酸钠二水合物和（0.5±0.03） g柠檬酸氢二钠倍水合物，这些量大致相当于样品中10 mL的水加入到上述提取液中，拧紧离心管立即剧烈震荡1 min后，离心5 min，转速高于5000 r/min。提取液待净化。

1.2.2 样品净化

对于土豆﹑山药等低色素蔬菜，分别转移6 mL上述提取液至已经含有150 mg PSA和900 mg无水硫酸镁的离心管中；对于菠菜﹑芹菜﹑葱等高色素蔬菜，分别转移6 mL上述提取液至已经含有150 mg PSA﹑45 mg GCB和900 mg无水硫酸镁的离心管中；对于基质复杂的姜，转移6 mL上述提取液至已经含有450 mg PSA和900 mg无水硫酸镁的离心管中。以上6种蔬菜均按照以下操作：拧紧离心管后剧烈震荡2 min，然后离心5 min，转速高于5000 r/min。取约1 mL的上述提取液过0.22 μm微孔滤膜到2 mL自动进样瓶中，供LC-MS/MS分析。

1.2.3 标准溶液的配制

将21种农药分别用甲醇配制成10 μg/mL单标储备溶液。将21种上述10 μg/mL单标储备溶液分成2组，用甲醇配制成1 μg/mL的2组混合标准储备溶液。从上述2组1 μg/mL的混合标准储备溶液中分别准确移取5 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL至2 mL进样瓶中，选用对应空白蔬菜按照1.2.2操作得到的空白蔬菜净化液配制成5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的对应蔬菜的基质匹配工作溶液，供LC-MS/MS分析。

1.2.4 LC-MS/MS仪器条件

1）液相部分。色谱柱：Eclipse Plus C₁₈，4.6 mm（内径）×150 mm， 粒径5 μm；流动相A：甲酸铵水溶液，c = 5 mmol/L；流动相B：甲酸铵-乙腈溶液，c = 5 mmol/L；色谱柱温度：40℃；进样量：5 μL。后运行时间8 min。流速和梯度洗脱见表1。

2）质谱仪部分。离子化模式：ESI⁺；扫描方式：MRM；毛细管电压：3.5 KV；干燥气温度：350℃；干燥气流量：10 L/min；雾化气压力：30 psi。21种农药的多反应监测质谱参数见表2。

表1 流速和梯度洗脱表

Table 1 Flow rate and gradient elution

2 结果与分析

2.1 蔬菜提取过程的优化

GB 23200.113—2018中7.1.1将蔬菜﹑水果和食用菌中的称样量统一定为10 g，未根据含水量进行区分，相比GB 23200.113—2018，GB 23200.121—2021中7.1将干制水果﹑蔬菜和食用菌称样量定为1.0 g，然后加9 mL水，同样也未对低含水量植物源性食品加以区分。以上两项标准对于含水量80%以上的合适，但是对于含水量在80%以下的部分植物源性食品，添加一定的纯水能改善提取效果^[6,8-9]。菠菜﹑芹菜﹑葱含水量均高于80%以上，因此不需要添加纯水。分别向土豆﹑山药均质样品中加入0 mL﹑1 mL﹑2.5 mL﹑5 mL﹑7 mL水，实验观察发现加入2.5 mL水匀浆效果最好，这与欧盟标准EN 15662:2018中添加水平一致。姜的含水量也在80%～40%之间，但是姜的基质相对复杂^[10-12]，因此将姜称样量定为5.0 g，加水量为6 mL。6种蔬菜加水提取情况见表3。AOAC方法（AOAC Offical Method 2007.01）采用的无水硫酸镁和氯化钠作为盐析试剂，而欧盟标准EN 15662:2018采用的是柠檬酸缓冲盐体系，为保证提取过程中pH值稳定性，故提取过程选用柠檬酸缓冲盐。

2.2 不同色素水平的蔬菜净化处理过程优化

在使用QuEChERS方法对植物源性食品进行净化的过程中，吸附剂的种类和用量对提高回收率、克服基质效应至关重要^[8-9]。净化常用到的净化剂有N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）和十八烷基硅烷（C₁₈）。PSA可有效去除脂肪酸、有机酸、亲脂性色素和糖类，但是使用过量会与部分农药中的-SH、-OH、-NH等官能团形成氢键，影响农残检测。GCB能有效去除具有平面结构的甾醇和色素类杂质，但其正六元环的表面结构也会使一些平面和对称结构的农药被吸附，影响农残检测。C₁₈可以有效地去除样品中油脂等干扰物，但同时对某些农药有吸附作用^[13-14]。GB 23200.113—2018中7.1.1和标准GB 23200.121—2021中7.1均提到对颜色较深的要加入GCB，但是未对“颜色深”的植物源性食品做出分类说明。土豆和山药含色素较少，可以仅使用PSA作为吸附剂，参考标准GB 23200.121—2021和EN 15662:2018每1 mL提取液中加入25 mg PSA。芹菜﹑葱﹑菠菜属于高色素蔬菜，提取过程除了加入PSA外，还需要加入一定量的GCB以去除色素，而GCB的加入量会影响到部分农药的提取效果^{[6,8-9,13-14]}，在芹菜提取液的净化过程中分别加入GCB的量为20 mg、45 mg、60 mg，实验观察发现GCB量增多后，净化液的颜色变浅，但是当GCB量为60 mg时，含有平面结构的多菌灵﹑甲霜灵等农药的回收率下降，与文献^[15-16]报道相符，因此GCB使用量定为45 mg，即每1 mL提取液中加入45 mg GCB，葱和菠菜加入GCB的量与芹菜一样，这与EN 15662:2018中GCB的加入量一致。对于基质复杂的姜^[10-12]，在提取液的净化过程中分别加入PSA的量为150 mg、300 mg、450 mg、600 mg，实验观察发现随着PSA用量的增多，净化液变得澄清，多数农药回收率增高，但是当使用量到600 mg时，硫线磷﹑比吡虫啉等农药的回收率下降，这与PSA可以与-SH、-OH、-NH等官能团的农药形成氢键有关^[13-14]，因此将姜使用的净化剂及用量定为PSA 450 mg，即每1 mL提取液中加入75 mg PSA。不同色素水平蔬菜使用吸附剂的种类和用量，见表4。

表4 不同色素水平蔬菜净化过程

Table 4 Purification of vegetables with different pigment levels

2.3 方法检出限和回收率

考虑基质效应的影响，采用基质匹配校准曲线来减少基质效应^[6,17-18]。分别使用芹菜﹑葱﹑菠菜﹑土豆﹑山药﹑姜6种蔬菜的空白基质配制5～100 ng/mL的21种混合农药的基质匹配校准曲线。以基质复杂的姜为例，使用空白姜为实验样品，添加5 ng/mL混合标准溶液进行实验，实验过程按1.2进行，综合考虑信噪比S/N为3和10时仪器响应值，计算方法检出限和定量限，结果见表5。

对6种蔬菜通过三浓度六水平进行回收率和精确度验证。在10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg 3个浓度水平下添加回收，每个浓度水平重复6次。结果见表6。

表6 6种蔬菜中21种农药残留的回收率和精密度

Table 6 Recoveries and precisions of 21 pesticide residues in 6 vegetables

2.4 抽检市场样品的实际检出情况

使用本文优化的QuEChERS前处理方法结合液相色谱串联质谱仪，对来自市场抽检的芹菜﹑葱、菠菜、土豆、山药、姜6种蔬菜共34批，检测21种农药残留，检出有农药残留的蔬菜12批，检出的农残项目为噻虫胺﹑啶虫脒﹑吡虫啉﹑噻虫嗪﹑甲霜灵﹑多菌灵，部分批次蔬菜同时检出2种以上农药残留。依据标准GB 2763—2021对检出农残的蔬菜进行判定，2批次蔬菜不合格，其中1批次生姜不合格，不合格项目为噻虫胺，另外1批次芹菜不合格，不合格项目为克百威，结果见表7，表中仅统计有检出的农药残留项目，其他农药在这6种蔬菜中均未检出。对于以上不合格的蔬菜，市场监管部门已按照程序进行了相关处理。

表7 蔬菜中农药残留检出情况

Table 7 Detection of pesticide residues in vegetables

注: 标*表示检出不合格的蔬菜及对应的农残项目

3 结论

本文通过对不同种类的蔬菜优化加水量和净化剂用量提高净化效果，建立了优化QuEChERS方法结合高效液相色谱串联质谱仪的测定方法，经验证可以快速﹑高效﹑准确地检测6种蔬菜中21种农药残留。从实际抽检蔬菜的检测结果看，本文建立的优化QuEChERS方法检出率高。本方法也可推广应用至不同种类植物源性食品中多种农药残留快速高效检测，可为植物源性食品中农药残留检测提供参考。

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基金项目：济南海关科研项目（2020JK008）

第一作者：张伟（1982—），男，汉族，山东昌乐人，高级工程师, 主要从事食品安全研究工作，E-mail: zngwi10@163.com

1. 东营海关技术中心 东营 257091

2. 临沂海关技术中心 临沂 276034

1. Dongying Customs Technical Center, Dongying 257091

2. Linyi Customs Technology Center, Linyi 276034

表2 21种农药多反应监测质谱参数

Table 2 Mass spectrometry parameters for multiple reaction monitoring of 21 pesticides

注: 加*的子离子为定量离子

表3 不同含水量蔬菜提取过程

Table 3 Extraction of vegetables with different water contents

表5 空白姜基质匹配的21种农药的线性方程、检出限和定量限

Table 5 Linear equations, detection limits and quantification limits of 21 pesticides matched with blank ginger matrix