李佳潼 陈林军 王安石 陈施明 刘福秀 潘英文

摘 要 为克服不同发育阶段和不同形态特征的检疫性杂草少花蒺藜草的形态鉴定限制，通过设计少花蒺藜草DNA条形码matK、ITS、rbcL、psbA和trnL序列引物并对其PCR反应体系优化，比较各序列的扩增和测序效率。结果表明：matK、ITS、rbcL、psbA和trnL序列引物对少花蒺藜草的扩增和测序成功率均较高，PCR反应的最佳退火温度分别为matK 56℃、ITS 60℃、rbcL 60℃、psbA 60℃、trnL 60℃。在上述反应体系和条件下获得清晰明亮的目的条带，matK、ITS、rbcL、psbA和trnL可作为鉴别检疫性杂草少花蒺藜草DNA条形码组合的参考序列。

关键词 检疫性；少花蒺藜草；DNA条形码；鉴定

DNA Barcode Identification System Establishment and Optimization of Quarantine Weed Cenchrus Spinifex Cav.

LI Jia-Tong¹ CHEN Lin-Jun² WANG An-Shi¹

CHEN Shi-Ming¹ LIU Fu-Xiu^1* PAN Ying-Wen^1#

Abstract To overcome the limitations of morphological identification of the quarantine weed Cenchrus spinifex at different developmental stages and with different morphological characteristics, the amplification and sequencing efficiencies of the sequences were compared by designing primers for the DNA barcodes matK, ITS, rbcL, psbA, and trnL sequences of Cenchrus spinifex and optimizing their PCR reaction systems.The results showed that the success rates of amplification and sequencing of Cenchrus spinifex were high with primers of matK, ITS, rbcL, psbA and trnL, and the optimal annealing temperatures for PCR reaction were matK 56°C, ITS 60°C, rbcL 60°C, psbA 60°C, trnL 60°C. The objective bands obtained under the above reaction system and conditions are clear and bright, and matK, ITS, rbcL, psbA and trnL can be used as a combination DNA barcode reference sequence to identify Cenchrus Spinifex Cav.

Keywords quarantine; Cenchrus spinifex; DNA barcode; identification

基金项目：海南省自然科学基金青年基金项目（321QN375）

第一作者：李佳潼（1988—），女，汉族，吉林吉林人，硕士，农艺师，主要从事植物检疫、植物物种鉴定研究工作，E-mail: 372463464@qq.com

通信作者：刘福秀（1973—），男，汉族，江西安福人，博士，研究员，主要从事植物检疫、植物病害等研究工作，E-mail: fuxiuliu@126.com

共同通信作者：潘英文（1981—），男，汉族，福建漳州人，博士，正高级农艺师，主要从事植物检疫、植物物种鉴定研究工作，E-mail: pyw910@163.com

1. 海口海关热带植物隔离检疫中心 海口 570311

2. 呼和浩特海关技术中心 呼和浩特 010020

1. Post-Entry Quarantine Station for Tropical Plant, Haikou Customs, Haikou 570311

2. Hohhot Customs Technology Center, Hohhot 010020

少花蒺藜草（Cenchrus spinifex Cav.）为一年生草本植物，原产于北美洲和热带沿海地区^[1]。我国首次发现少花蒺藜草是在20世纪30年代^[2]，已被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。少花蒺藜草入侵性和抗逆性极强，种子繁殖率高^[3-4]，在恶劣的环境条件下也能结实，萌发形成植株，给生态系统造成了严重的破坏^[5]。少花蒺藜草繁殖体存在倒钩结构，进境粮食及种质资源引进容易携带其种子或繁殖体。随着我国经济的快速发展、口岸对外开放程度的不断深入，粮食贸易和种质资源交流更加频繁，植物检疫任务愈加繁重。目前，国内外对杂草的鉴定主要通过形态学特征进行观察分析，但仅依靠形态学鉴定很难做出准确的鉴定，特别是植物发育不完全或只有部分植株材料。经过加工处理后杂草的原有性状特征均已消失，难于通过性状鉴定的方法进行有效鉴定。蒺藜草属植物种类繁多，种间仅凭形态特征较难分辨，同时地理分布较近的种类分子水平差异较小，因此建立检疫性杂草少花蒺藜草DNA条形码鉴定体系，是该领域亟待解决的技术难题。

近年来，分子生物学技术快速发展，DNA条形码技术已被应用于多种检疫性杂草的快速鉴定^[6]。自Herbert等^[7]提出以来，为物种鉴定提供了快速有效的研究方法。而基于DNA条形码技术的快速物种鉴定，近年来在植物检疫工作中也取得了广泛应用^[8]。目前，植物物种大多采用DNA条形码方法如atpF-atpH、rbcL、rpoB、rpoC1、psbA、trnL、matK和核糖体ITS等序列来加以鉴定^[9]，但缺乏系统性的研究。目前，仅靠一个片段很难对所有的植物物种进行准确鉴定，针对特定物种采用多个不同的基因片段进行综合分析鉴定将是今后的主要研究方向。笔者通过对现有序列和数据的比对分析，选择matK、ITS、rbcL、psbA和trnL 5 种DNA条形码序列进行检疫性杂草少花蒺藜草DNA条形码鉴定体系建立与优化，旨在建立少花蒺藜草DNA条形码的鉴定体系，以解决识别效率低的问题，为DNA条形码技术在杂草鉴定中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料采集于内蒙古通辽市（N:43°00.867′, E:122°25.094′），采集植株后用变色硅胶迅速干燥带回实验室，常温下保存。引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.2 DNA提取

采用试剂盒法提取DNA，购于天根生化科技（北京）有限公司。选取少花蒺藜草叶片提取DNA。使用Thermo Nanodrop 2000核酸分析仪测定提取的DNA样品230 nm、260 nm和280 nm处的光吸收值，根据OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀的比值确定DNA纯度。

1.3 引物设计

选取matK、ITS、 rbcL、psbA和trnL基因序列，根据已知检疫性少花蒺藜草的序列，利用其保守位点和变异位点，用Primer Premier 6软件，设计少花蒺藜草的matK、ITS、 rbcL、psbA和trnL序列引物，引物序列见表1。

表1 PCR反应引物序列

Table 1 The primer sequence of PCR amplification

1.4 PCR反应体系优化

PCR反应体系：10 μL 2×PrimeStar Max premix（TaKaRa），0.4 μmol·L^-1引物，6～10 mg·L^-1模板DNA，用ddH₂O补充至20 μL。反应程序：94℃预变性8 min；94℃变性45 s，52～64℃（温度变化梯度2℃）退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸6 min，4℃保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，以DL2000 Marker (TaKaRa) 为参照，凝胶成像系统下观察并拍照。

1.5 PCR扩增、测序和变异分析

将测序所获得的核苷酸序列用DNAMAN 6.0软件校正编辑，通过BLAST （https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行比对分析，与GenBank数据库中已知的少花蒺藜草核苷酸序列进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 PCR反应体系优化

通过设计少花蒺藜草DNA条形码matK、ITS、rbcL、psbA和trnL序列的引物并对其PCR反应体系优化，进行PCR扩增、测序和序列变异分析，从图1可知，matK序列PCR扩增退火温度为56℃时，扩增条带清晰，亮度较高，稳定性好。由图2—图5可知，ITS、rbcL、psbA、trnL序列PCR扩增退火温度为60℃时，扩增条带清晰，亮度较高，稳定性好。matK、ITS、rbcL、psbA和trnL序列引物的PCR扩增均获得理想带型。

A. 52℃; B. 54℃; C. 56℃; D. 58℃; E. 60℃; F. 62℃; G. 64℃

图1 matK序列不同退火温度的扩增结果

Fig.1 Results of PCR amplification in different anneal

temperature by primer matK

A. 52℃; B. 54℃; C. 56℃; D. 58℃; E. 60℃; F. 62℃; G. 64℃

图2 ITS序列不同退火温度的扩增结果

Fig.2 Results of PCR amplification in different anneal

temperature by primer ITS

A. 52℃; B. 54℃; C. 56℃; D. 58℃; E. 60℃; F. 62℃; G. 64℃

图3 rbcL序列不同退火温度的扩增结果

Fig.3 Results of PCR amplification in different anneal

temperature by primer rbcL

A. 52℃; B. 54℃; C. 56℃; D. 58℃; E. 60℃; F. 62℃; G. 64℃

图4 psbA序列不同退火温度的扩增结果

Fig.4 Results of PCR amplification in different anneal

temperature by primer psbA

2.2 PCR扩增和序列分析

使用优化后的PCR反应体系对少花蒺藜草matK、ITS、rbcL、psbA和trnL序列进行扩增，其序列长度分别为538 bp、549 bp、543 bp、574 bp、500 bp，长度符合DNA条形码片段要求。PCR 扩增效率和测序效率均较高，除psbA 的测序效率为96.7%，其他片段的扩增和测序效率均为100%。该反应体系稳定可靠，能满足DNA条形码检测鉴定的实验要求，如图1—图5所示。

3 结论与讨论

扩增成功率是DNA条形码应用的主要限制因素，少花蒺藜草在物种水平上具有较高的遗传多样性^[10]，且遗传变异大部分来源于种群内，导致其识别效率和扩增成功率下降^[11]，对PCR反应条件进行摸索和优化十分必要。引物的优劣直接关系到 PCR扩增的特异性及成功与否，退火温度是影响PCR 反应的关键因素，退火温度的高低对DNA条形码鉴定基因序列扩增的带型和背景深浅有明显的影响。退火温度过低时，非特异结合增加，容易产生弥散状背景，降低测序效率。但过高时引物与模板又不易结合，PCR反应效率降低，目标条带亮度降低。DNA条形码技术在实际应用中尚存在许多问题需要解决，包括DNA条形码基因的选择以及种内和种间变异范围界定。本研究通过设计少花蒺藜草DNA条形码matK、ITS、rbcL、psbA和trnL序列引物，并对其PCR反应体系进行优化，取得了较好的效果，解决了检疫性杂草少花蒺藜草识别效率低的问题。但matK、ITS、rbcL、psbA和trnL作为鉴别少花蒺藜草DNA 条形码组合的参考序列，在实践应用中还存在一定的局限性。下一步，笔者将基于高通量基因组测序，探索更为高效的DNA条形码基因序列，简化DNA条形码鉴定流程，完成从原始序列到物种鉴定的实践应用。

参考文献

[1]李振宇, 解焱. 中国外来入侵生物[M]. 北京: 中国林业出版社, 2002: 71.

[2]高晓萍, 杨旋. 疏花蒺藜在阜新的分布、危害及防控措施[J]. 植物检疫, 2008, 22(1): 64-65.

[3]郝阳春, 张董. 少花蒺藜草在阜新的分布、危害及防控措施[J]. 内蒙古林业调查设计, 2012, 35(1): 79-82.

[4]杜广明, 曹凤芹, 刘文斌, 等. 辽宁省草场的少花蒺藜草及其危害[J]. 中国草地, 1995, 17(3): 71-73.

[5]孙英华, 吕林有, 赵艳. 少花蒺藜草入侵风险评估及其防控策略[J]. 安徽农业科学, 2011, 39(8): 4580-4581.

[6]金光耀, 庄黎萍. 分子生物学检测技术在我国进出境植物检疫中的应用及展望[J]. 安徽农业科学, 2017, 45(2): 100-102.

[7] Hebert P D, Cywinska A, Ball S.L. Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society B[J]. Biological Sciences, 2003, 270(1512): 313-321.

[8]谈静惠, 贺生芳, 郭澍强. DNA条形码技术在植物检疫中的应用探究[J]. 南方农业, 2019, 13(3): 187-191.

[9] Renaud L, Michelle vander Bank, Diego B, et al. DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 2008, 105(8): 2923-2928.

[10]杨新英, 梁晓慧, 贺俊英, 等. 入侵植物光梗蒺藜草ISSR遗传多样性分析[J]. 内蒙古林业科技, 2018, 44(1): 13-19.

[11 ]张衍雷. 少花蒺藜草遗传多样性及萌发、繁殖特性研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2015.

A. 52℃; B. 54℃; C. 56℃; D. 58℃; E. 60℃; F. 62℃; G. 64℃

图5 trnL序列不同退火温度的扩增结果

Fig.5 Results of PCR amplification in different anneal

temperature by primer trnL