陈子凡 董莹 郑少锋 陈碧聪 张南峰

摘 要 本文建立一种测定腌渍蔬菜中三氯蔗糖的超高效液相色谱串联质谱仪-正电离喷雾模式（ESI+）的方法。腌渍蔬菜样品用乙腈作为提取液，加入QuECHERS试剂振摇，离心后取上层澄清液，过0.22 μm滤膜后上机检测。液相色谱采用C₁₈色谱柱，以超纯水和甲醇为流动相梯度洗脱分离目标物。质谱选择419 m/z作为前体离子，239 m/z作为定量离子，221 m/z、203 m/z作为定性离子，采用外标法进行定量。结果表明三氯蔗糖的标准曲线在0.5～100 ng/mL之间呈线性关系，相关系数R²＞0.998，加标回收率为84.3%～99.1%，精确度为5.3%，检出限为0.1 μg/kg，定量限为0.2 μg/kg。结果表明，该方法具有快速高效、检测下限低、灵敏度高、重复性好的特点，可作为腌渍蔬菜中三氯蔗糖含量测定方法。

关键词 三氯蔗糖；超高效液相色谱；三重四极杆质谱；电离喷雾正模式；腌渍蔬菜

Determination of Sucralose in Pickled Vegetables by

UHPLC- MS/MS with Electrospray Ionization Positive Mode

CHEN Zi-Fan ¹ DON G Ying ^2,3 ZHENG Shao-Feng ^2,3 CHEN Bi-Cong ¹ ZHANG Nan-Feng ^2,3*

Abstract An ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry electrospray ionization positive mode (ESI+) method was developed for the determination of sucralose in pickled vegetables.The pickled vegetable sample was extracted with acetonitrile and shaken with QuECHERS reagent. The upper clear solution was taken via centrifugation, and passed through 0.22 μm Perform machine testing after filtering the membrane. Liquid chromatography uses C₁₈ column, with ultrapure water and methanol as the mobile phase for gradient elution and separation of the target substance. The mass spectrometry selected 419 m/z as the parent ion, 239 m/z as the quantitative ion, and 221 m/z and 203 m/z as the qualitative ions. The external standard method was used for quantification. The results show that the standard curve of sucralose exhibits a linear relationship between 0.5 and 100 ng/mL with a correlation coefficient R²＞0.998. The added standard recovery rate was 84.3% to 99.1%, the relative standard deviation 5.3%, and the detection limit 0.1 μg/kg, with a quantification limit of 0.2 μg/kg. With low detection limit, high sensitivity, and good repeatability, this method is rapid and efficient in determining the content of sucralose in pickled vegetables.

Keywords sucralose; high-performance liquid chromatography (HPLC); triple quadrupole mass spectrometry; electrospray ionization positive mode; pickled vegetables

第一作者：陈子凡（1981—），男，汉族，广东河源人，本科，高级工程师，主要从事商品检验、仪器分析工作，E-mail: chenzifan@21cn.com

通信作者：张南峰（1979—），男，汉族，广西南宁人，博士，研究员，主要从事商品检验、仪器分析工作，E-mail: nf_zhang@126.com

1. 河源市食品检验所 河源 517000

2. 黄埔海关技术中心 东莞 523000

3. 广东省口岸安全智能化检测重点实验室 广州 510510

1. Heyuan Food Inspection Institute, Heyuan 517000

2. Huangpu Customs District, Dongguan 523000

3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Intelligent Port Security Inspection, Guangzhou 510510

三氯蔗糖是市面上常用的甜味剂，口感接近蔗糖但优于其他甜味剂。粮农组织/世卫组织食品添加剂联合专家委员会（JECFA）建议三氯蔗糖的ADI值（每日允许摄入量）为15 mg/(kg·bw)。我国标准 GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》和欧盟法规（EC）No 1333/2008 the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on food additives（Text with EEA relevance）均规定了食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的使用范围、限量要求，主要区别为不同类别产品的允许添加限量差异较大，欧盟法规规定的产品适用范围较广。在GB 2760—2014中，三氯蔗糖作为甜味剂，允许用于乳制品、焙烤食品等食品类别，在腌渍蔬菜中限量使用值为0.25 g/kg。

GB 5009.298—2023《食品安全国家标准 食品中三氯蔗糖(蔗糖素)的测定》已在2024年3月6日实施，与旧版本相比，新增“高效液相色谱-串联质谱法”，使用了ESI-模式。本研究采用ESI+检测腌渍蔬菜中的三氯蔗糖，具有较高的电离效率，产物离子的强度高，可以获得更低检测限和灵敏度，而且可以使用“甲酸+水∶甲醇”等促质子化的流动相，无需更换乙酸铵等抑制质子化的流动相^[1-5]，可以与腌渍蔬菜中其他使用ESI+的甜味剂，如糖精钠、山梨酸钠等同时进行测定，从而降低成本、提高检测效率，在实际检测中有更强的可操作性。该方法在日本岛津公司应用资料中有提及^[6-7]，国内文献中鲜有相关研究报道。

本研究采用（ESI+）对三氯蔗糖进行检测，通过标准品优化得出正模式下的前体离子和产物离子，建立质谱检测方法，以期为食品检测单位和生产企业分析三氯蔗糖提供新的方向。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

超高效液相色谱-质谱联用仪（UHPLC-MS/MS）：TSQ Endura型，配ESI电喷雾系统，Thermo TSQ Endura Tune质谱优化软件，X Calibur质谱计算软件，（Thermo Fisher Scientific Inc）；超纯水机：Direct16型（Merck KGaA，Darmstadt，Germany）；电子天平：CP225D型（赛多利斯公司）；均质机：Gd-300（深圳新锐公司）；高速离心机：ST 16R型（Thermo Fisher Scientific Inc）。

1.2 试剂与材料

三氯蔗糖标准品（99.6%，中国计量科学研究院）；QuEChERS试剂（6.0 g 硫酸镁，1.5 g 乙酸钠，日本岛津公司）；陶瓷均质子（日本岛津公司）；PTFE针头过滤器：Target2型（0.22 μm，美国赛默飞世尔科技公司）；乙腈，甲醇（色谱纯，霍尼韦尔公司）；榨菜丝和橄榄菜样品（市售）；屈臣氏蒸馏水（500 mL/瓶）。

1.3 标准溶液的配制

0.5 mg/mL标准储备液：准确称取50.0 mg三氯蔗糖标准品，移入至100 mL容量瓶中，用甲醇水（90∶10）溶液溶解后，定容至刻度线。

1 μg/mL标准中间液：准确移取0.2 mL标准储备液至100 mL容量瓶中，用甲醇水（90∶10）溶液定容至刻度线。

系列标准工作液：分别移取标准中间液，用甲醇水（90∶10）溶液稀释至100.00 ng/mL、50.00 ng/mL、12.50 ng/mL、5.00 ng/mL、1.25 ng/mL、0.50 ng/mL，制备成三氯蔗糖系列标准工作液。

1.4 样品前处理

1.4.1 样品制备

取代表性样品，将其剪碎成约2 mm×2 mm大小，用食品处理机搅碎后，放入清洁的试样袋中，作为试验样品。

1.4.2 样品提取

称取1.00 g试样，放入50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，使用均质机进行均质。加入QuEChERS试剂包、陶瓷均质子，进行振摇15 min，再以8000 r/min转速离心15 min。取离心后的上清液，转移至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度线，经0.22 μm PTFE滤膜过滤后供UHPLC-MS/MS检测^[8-9]。

1.5 实验条件

1.5.1 液相色谱仪

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS C₁₈柱（100Å，1.8 μm，2.1 mm×100 mm），Waters Corporation；流动相：A相为超纯水，B相为甲醇；色谱柱温度：35℃；进样体积：10 μL，进样器温度：15℃；淋洗方式：梯度淋洗，淋洗程序见表1。

表1 梯度淋洗程序

Table 1 Gradient conditions used for the LC separation

1.5.2 质谱仪

离子源条件：正电离电压3200 V，鞘气35 Arb，辅助气5 Arb，离子传输管温度300℃，蒸发温度320℃；扫描方式：SRM，驻留时间，100 ms，Q1分辨率0.7（FWHM），Q3分辨率0.7（FWHM），碰撞气为99.99%氩气，1.5（mTorr），分析峰宽6 s。三氯蔗糖的质谱参数见表2。

表2 质谱方法设置

Table 2 MS method setup in software

注: 带*为定量离子

1.6 实验步骤

使用1.3仪器方法，对三氯蔗糖系列标准工作液和样品液进行测定，同时测量空白溶液。以三氯蔗糖特征定量离子所得的质谱峰面积为纵坐标，相应的三氯蔗糖质量浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，采用外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

拆除TSQ Endura质谱ESI的连接管线及色谱泵出口管路，使用三通管连接500 μL进样针，1号口连接液相泵出口，2号口连接ESI源样品进口（图1）^[8]。使用注射泵将标准工作液混合流动相注入质谱联用仪。在色谱软件Chromeleon中设置液相泵为0.3 mL/min，梯度设置按需要调整比例。在质谱软件Thermo TSQ Endura Tune中注射泵进样速度为50 μL/min。

图1 ESI优化接线图

Fig.1 ESI optimized connectivity diagram

将1 mg/mL标准溶液直接进至液相色谱质谱联用仪，在Tune软件中运行Optimization，得出Compound Optimization Result Report，获得前体离子报告和产物离子信息。三氯蔗糖标准品的前体离子和产物离子信息如图2、图3所示。图1中419 m/z，421 m/z，423 m/z为同位素峰，其比例约为1∶1∶0.3，可以确定为三氯蔗糖的前体离子。图1中未发现397 m/z的[M+H]⁺碎片，这与文献所述只出现[M+Na]⁺的结果相符^[9]。因此，本研究选择使用强度最高的419 m/z离子作为前体离子。图2为三氯蔗糖的产物离子图。从图2数据可以看到产物离子强度为1.44E+005，相对图1进行的Q1全扫强度6.88E+006，产物离子强度高，电离效率好。因此，419 m/z作为前体离子，239 m/z定量离子，221 m/z、203 m/z作为定性离子。

图2 ESI+前体离子谱图

Fig.2 Ion spectrum of ESI+ precursor

2.2 正负离子模式的比较

在Tune软件中运行ESI-模式优化，前体离子选择395 m/z，产物离子结果如图4所示。负离子模式只有一个10⁴强度的395.0 m/z产物离子，这是因为三氯蔗糖在ESI-中裂解，丢失一个Cl自由基后，形成较为稳定的产物。在ESI-中，395 m/z的前体离子有10⁶强度，而产物离子只有10⁴强度，ESI+的419 m/z的前体离子有10⁶强度，而产物离子只有10⁵强度，说明电离效果更好。

图3 ESI+产物离子谱图

Fig.3 Ion spectrum of ESI+ product

图4 ESI-产物离子谱图

Fig.4 Ion spectrum of ESI- product

ESI-模式的碰撞能量图如图5所示，可以发现在ESI-模式下，359 m/z离子不需要增加电压，就直接裂解，稳定性差，而35 m/z强度非常低而且增加能量，也不能使得强度增加，不适合作为产物离子。

ESI+模式的碰撞能量图如图6所示，239 m/z和221 m/z离子不在20 V有一个峰值，稳定性好，特征明显，可以作为产物离子使用。因此，采用ESI+模式，具有更高的灵敏度和抗干扰性。

2.3 QuECHERS方法的优化

腌渍蔬菜通常含有较多的油脂，并且添加有色素，采用甲醇或乙腈萃取，或直接稀释法，均无法去除油脂和色素，会造成质谱损坏。而采用固相萃取柱子，则需要洗脱溶液和复杂的洗脱、浓缩、复溶等操作。QuECHERS法被广泛用于农产品药物残留检测中，用作快速前处理，可以去除色素等干扰物质。宋佳等^[10]应用QuECHERS法用于酱油、酱制品中三氯蔗糖的前处理，效果明显。由于腌渍蔬菜中常含有酱油或油脂等物质，本研究使用原料配比固定的商业化QuECHERS试剂^[10]，用于腌渍蔬菜中三氯蔗糖的测定，回收率在84.3%～99.1%之间，和文献使用的HLB固相萃取柱的回收率相当^[9]。因此，使用QuECHERS试剂作为本方法的前处理，具有更简单、快速的优点。

2.4 基质效应的评价

由于腌渍蔬菜产品中添加有离子颗粒物（盐类等）、等强极性化合物（色素等）和有机化合物（糖、脂等），而且在QuECHERS前处理中，也会带入试剂残留物，因此本研究采用了基质效应（ME）评价基质影响。将空白样品按1.4进行处理后，得到空白基质提取液，吸取1 mL提取液放入进样瓶中，再加入三氯蔗糖标准溶液，使其含有15 ng三氯蔗糖。计算结果见表3，基质效应因子为3.1%，ME＜20%表示弱基质效应，可忽略^[11]。

表3 基质效应评价结果

Table 3 Results of matrix effect evaluation

2.5 线性关系和检出限

按1.5步骤对三氯蔗糖标准工作液进行检测，X Calibur软件给出标准曲线的线性方程和相关系数，为Y = 6872.69X + 8601.17，R²＞0.998，表明线性良好。按GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》，对测定低限进行计算，其中4次空白的S₀为2.98%，得测定低限为0.1 μg/kg，定量限为0.2 μg/kg。

2.6精密度试验

在腌渍蔬菜空白样品中加入三氯蔗糖，使其含有10 μg/kg的三氯蔗糖，按1.3方法处理后连续进样9次，计算其实验室内变异系数（CV）%，试验结果见表4，变异系数为5.3%，满足GB/T 27404—2008中含量为10 μg/kg时，变异系数为21%的要求。

2.7 加标回收试验

在榨菜丝和橄榄菜两种腌渍蔬菜空白样品中分别加入三氯蔗糖，使其含有50 μg/kg、150 μg/kg、400 μg/kg的三氯蔗糖，按照前述方法进行前处理，每个样品制备6份，以6次检测结果的平均值作为测定值。结果表明（表5），三氯蔗糖的回收率为84.3%～99.1%，满足GB/T 27404—2008中含量＜0.1 mg/kg时，回收率需在60%～120%之间的要求，相对标准偏差（RSD）为0.79%～3.17%（n = 6）。空白样品质谱图、加标样品质谱图如图7、图8所示。

3 结论

本研究建立了超高效液相色谱串联质谱仪(ESI+)模式测定食品腌渍蔬菜中的三氯蔗糖方法，实现了(ESI+)下三氯蔗糖的定性定量分析。该方法标准曲线相关系数大于0.998，检出限为0.1 μg/kg，定量限为0.2 μg/kg，精密度为5.3%，回收率为84.3%～99.1%，相对标准偏差为0.79%～3.17%，所得结果符合GB/T 27404—2008要求中对检测方法确认的技术要求。

本方法采用了QuECHERS方法进行前处理，使用水+甲醇流动相，ESI+模式下检测，可以同时检测腌渍蔬菜中糖精钠等甜味剂，缩短了检测时间，提高了检测效率，比ESI-方法具有操作更简单、成本更低廉、更环保的优点。

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图5 ESI-碰撞能量图

Fig.5 Breakdown curve of ESI-

图6 ESI+碰撞能量图

Fig.6 Breakdown curve of ESI+

表4 精密度试验结果

Table 4 Results of precision test

表5 加标回收试验结果

Table 5 Results of spiked recovery test

图8 加标样品谱图

Fig.8 Spectrum of spiked sample

图7 空白样品谱图

Fig.7 Spectrum of blank sample