张杰 姚依妮 王琦 章超 赵亚运 沈飚 何明 郑蔚涛

摘 要 石油烃污染持续时间长、去除难度大，如何优化石油成分的降解条件，有效去除石油烃污染日益受到国内外重视。鞘氨醇单胞菌的细胞外膜中不含脂多糖，但是却含有一种鞘糖脂，它所形成的疏水表面更有利于细胞摄取胞外物质。本实验选择易被微生物所降解的柴油作为碳源，设计实验对多噬香鞘氨醇单胞菌降解柴油的温度、振荡器转速、pH、石油污染物浓度、投菌量、表面活性剂等条件进行优化。实验结果显示，多噬香鞘氨醇单胞菌在柴油浓度0.1 g/L，35℃，pH = 7.2，转速为220 r/min^-1时降解效果较好。实验还针对枯草芽孢杆菌能分泌表面活性剂的特点，分析鞘氨醇单胞菌与枯草芽孢杆菌共同降解的可行性，包括以生物炭为载体来防止细菌的相互干扰，以期在后续实验中提高降解效率。

关键词 鞘氨醇单胞菌；鞘糖脂；多噬香鞘氨醇单胞菌；优化；表面活性剂；枯草芽孢杆菌；生物炭

Optimization of Oil Degradation Conditions by Sphingosinomonas and Bacillus subtilis

ZHANG Jie^1* YAO Yi-Ni² WANG Qi² ZHANG Chao⁴ ZHAO Ya-Yun³

SHEN Biao² HE Ming² ZHENG Wei-Tao³

Abstract Petroleum hydrocarbon pollution has been widely concerned because of its long duration and difficulty in pollution removal. How to optimize the degradation conditions of petroleum components and effectively remove petroleum hydrocarbon pollution has been paid increasing attention at home and abroad. The outer membrane of Sphingosinomonas does not contain Lipopolysaccharides, but it does contain a Glycosphingolipid that forms a hydrophobic surface, which is more conducive to the uptake of extracellular substances. In this experiment, diesel fuel that is easily degraded by microorganisms was selected as the carbon source, and the temperature, oscillator speed, pH, concentration of petroleum pollutants, amount of bacteria, surfactant and other conditions were optimized for the degradation of diesel by Sphingomonas polyaromaticivorans. The experimental results showed that the degradation effect of Sphingomonas polyaromaticivorans was better when the concentration of diesel fuel was 0.1 g/L, 35°C, pH = 7.2, and the rotation speed was 220 r/min^-1. In view of the characteristics of Bacillus subtilis that can secrete surfactants, the feasibility of co-degradation of Sphingosinomonas and Bacillus subtilis was analyzed, including using biochar as a carrier to prevent bacterial interference, in order to improve the degradation efficiency in subsequent experiments.

Keywords Sphingosinomonas; Glycosphingolipids; Sphingomonas polyaromaticivorans; optimization; surfactant; Bacillus subtilis; biochar

基金项目：舟山市科技计划项目（2019C31046）

第一作者：张杰（1986—），男，汉族，浙江湖州人，硕士，工程师，主要从事微生物检验工作，E-mail: zhangjie16@customs.gov.cn

1. 湖州海关综合技术服务部 湖州 313000

2. 舟山海关综合技术服务中心 舟山 316000

3. 湖州海关 湖州 313000

4. 宁波海关综合技术服务中心 宁波 315000

1. Huzhou Customs Technical Centre, Huzhou 313000

2. Zhoushan Customs Technical Centre, Zhoushan 316000

3. Huzhou Customs, Huzhou 313000

4. Ningbo Customs Technical Centre, Ningbo 315000

石油烃污染因其持续时间长、去除难度大而受到广泛关注。微生物修复是在以小时为单位的周期（48～72 h）内通过吸收、降解、转化等作用减弱碳氢化合物的危险性并最终将其分解为CO₂和H₂O的过程^[1-2]，相比其他修复方式，修复效率更高，所以有更广阔的应用前景。鞘氨醇单胞菌的细胞外膜中含有鞘糖脂而不含脂多糖，细胞外膜所形成的疏水表面更有利于摄取细胞外物质。在石油烃污染环境中，石油降解菌的比例可达10%左右^[3]，且石油降解菌对油品的降解能力也较强。一般情况下，微生物降解石油烃的前后顺序为支链烷烃＞环烷烃＞多环芳烃＞杂环芳烃^[4]。主要燃油种类及组成见表1。根据石油生物在通常情况下优先代谢降解C₁₀-C₁₈碳链的烃类，煤油和柴油比汽油更容易受石油微生物的污染^[5]。因而，笔者选择柴油作为多噬香鞘氨醇单胞菌降解的对象。

表1 主要燃油种类及组成

Table 1 Main types of fuel and their compositions

微生物的生长主要受到所处环境的影响，优化鞘氨醇单胞菌对油品的降解条件，可提高该菌对油品的降解效率和降解率。表面活性剂能促进细菌对环境物质的吸收，相比化学合成表面活性剂，生物表面活性剂具有更强的生物降解能力和极端环境适应性，并且具有无毒或毒性极低^[6]的特点。研究发现枯草芽孢杆菌自身能产生生物表面活性剂，可降解87%的石油烃^[7]，枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性剂有助于微生物对石油烃的降解。

国内外相关研究表明，协同作用可以使混合菌对油品的降解效果相对于单株菌有明显的提升^[8]。Rahman等^[9]通过研究发现3周内从原油污染的土壤中分离出的优势降解菌组成的菌群对原油的降解率达78%，而单个菌种的降解率最高只有66%。王卓颖等^[10]从多处受石油及其制品污染的土壤中筛选到6株对高浓度机油等相关石油制品具有降解能力的微生物菌种，实验发现混合菌的除油效果明显好于单菌，最高降解速率可到0.64 g/L·d。

一般情况下，在油品降解实验中将鞘氨醇单胞菌和枯草芽孢杆菌同时投放能够促进石油烃的降解，但鉴于微生物易形成竞争关系，且该生物表面活性剂对鞘氨醇单胞菌降解石油烃的促进作用待定，故降解实验中需要对两者的相互作用进行研究思考。鞘氨醇单胞菌的实验条件，也需要通过实验来优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 降解菌株

菌株购自日本微生物菌种保藏中心（JCM）；菌株为多噬香鞘氨醇单胞菌，菌株保藏编号：JCM 16711。

1.1.2 基础发酵培养基和种子培养基

蛋白胨0.5%；氯化钠0.5%；牛肉膏0.3%；调溶液pH至7.0～7.2，121℃灭菌20 min。

1.1.3 筛选培养基

NaN0₃ 1.5 g；(NH₄)SO₄ 1.5 g；K₂HPO₄ 1.0 g；MgSO₄·7H₂O 0.50 g；KCl 0.50 g；FeS0₄·7H₂O 0.010 g；CaCl₂ 0.0020 g；蒸馏水1000 mL；原油 5.0 g；将溶液调至pH 7.0，121℃灭菌20 min。

1.1.4 溶菌肉汤培养基（LB培养基）

胰蛋白胨10 g；酵母浸膏5 g；NaCl 10 g；去离子水1 L；pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min。固体培养基在液体培养基成分基础上外加琼脂15 g。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的活化、鉴定及驯化

将西林瓶菌种打管复活，菌种接种于LB平板和液体培养基，30℃培养24～48 h，分别挑取单菌落和菌液至种子培养基（约50 mL）中，28℃振荡（180 r/min）培养24 h。24 h内每2 h取样1次，稀释涂平板，计数，测定生长曲线。

对菌株进行革兰氏染色，镜检，划平板，观察形态，并进行生化实验。同时用VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定仪进行细菌鉴定，对照生化实验结果。

挑取菌株，扩大培养后，吸取2 mL接种到200 mL液体筛选培养基中。待出现稠油洗脱效果后，不断加大稠油浓度（0.5%、1%、2%、3%、5%、8%、10%、12%、15%）并提高温度，继续转接。在转接过程中，将效果好的菌液甘油保种。

1.2.2 单因素实验

1）温度对柴油降解率影响实验。吸取驯化后降解效果较好的菌株2 mL接种到200 mL液体筛选培养基中（pH值为7），参考发酵条件优化实验，在25℃、30℃、35℃、40℃等温度下培养，分别设置空白对照一个，逐天观察降解率和降解速度，7 d后选择最适降解温度。

2）pH值对柴油降解率影响实验。吸取驯化后降解效果较好的菌株2 mL，35℃条件下，参考发酵条件优化实验，接种至200 mL液体筛选培养基中，pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0等，分别设置空白对照一个，逐天观察降解率和降解速度，7 d后选择最适降解pH。

3）叶轮转速对柴油降解率影响实验。吸取驯化后降解效果较好的菌株2 mL，35℃条件下，参考发酵条件优化实验，接种至200 mL液体筛选培养基中，设置了叶轮转速为180 r/min、200 r/min、220 r/min、250 r/min、380 r/min等多个处理，以及0 r/min作为对照，逐天观察降解率和降解速度，7 d后选择最适转速。

4）柴油浓度对降解率影响实验。吸取驯化后降解效果较好的菌株2 mL，35℃条件下，参考发酵条件优化实验，接种至200 mL柴油浓度为0.05 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.5 g/L液体筛选培养基中，逐天观察降解率和降解速度，7 d后选择最适柴油浓度。

1.2.3 正交实验

参照单因素实验结果，使用软件正交设计助手绿色版对正交实验因素及水平进行分析，实验各因素及水平见表2，实验不考虑各因素之间的交互影响。

表2 实验因素及水平

Table 2 Experimental factors and levels

1.2.4 降解率计算

取0.5 mL样品稀释至25 mL，于紫外可见分光光度计224 nm处测定其吸光度值，对照柴油的标准曲线，计算降解率η%，公式为：

×100%

式中，η%为降解率，C_初始为柴油初始浓度，C_最终为柴油最终浓度。

2 结果与讨论

购置的菌株经过打管、培养，在TSA培养基上呈现黄色，圆形，有光泽菌落，经革兰氏染色，显微镜下菌呈现粉红色，为革兰氏阴性，如图1所示。

图1 显微镜下的鞘氨醇单胞菌

Fig.1 Sphingosinomonas under the microscope

菌株通过VITEC鉴定，鉴定结果确为鞘氨醇单胞菌，其生化实验结果见表3。菌株通过驯化，其对油品的降解能力也得到进一步增强。

表3 生化实验结果

Table 3 Results of physiological and biochemical experiments

注: “+”表示阳性反应, “-”表示阴性反应

2.1 单因素实验结果

2.1.1 温度对柴油降解率的影响

温度是油品降解的重要因素，酶的活性随温度上升而增加，从而使细菌生长速率提高。但当温度超过最适温度后，首先酶的活性降低，甚至有的酶出现失活现象，同时培养液中溶解氧浓度下降，从而导致细菌生长速率降低。鞘氨醇单胞菌对柴油的降解率从25℃开始逐步升高，在35℃时最高（75.82%），40℃开始下降。温度在25℃以下时，多噬香鞘氨醇单胞菌生长缓慢、活性低，分泌物产量少，柴油降解率低。当菌液温度上升至30℃时，降解率明显增加。在温度达到约35℃时，多噬香鞘氨醇单胞菌处于最适温度，生物活性最高，柴油降解率最大。温度升至40℃时，由于蛋白质变性，细胞内酶活性降低，柴油降解率下降。

2.1.2 pH值对柴油降解率的影响

微生物代谢过程中存在一个最适pH值，此时细菌酶活性最强，菌体生长繁殖迅速。从初始pH = 5.5开始（降解率约为55.2%），随着初始pH值的升高，柴油降解率逐步升高，当培养基起始pH值达到7.2时降解率达到最高（降解率约为71.2%），之后逐步下降。

2.1.3 叶轮转速对柴油降解率的影响

通过实验，当转速达到220 r/min时，多噬香鞘氨醇单胞菌对柴油的降解效果最好。叶轮转速太低会影响菌液通气效果，从而导致菌液含氧量过低，不利于多噬香鞘氨醇单胞菌生长，但转速太高时，可能会造成叶轮对菌体的损伤而影响多噬香鞘氨醇单胞菌的生长。

2.1.4 柴油浓度对降解率的影响

石油污染物浓度是最强的影响因素，多噬香鞘氨醇单胞菌对不同浓度柴油降解率如图2所示，随着菌液中柴油质量浓度的增加柴油降解率逐渐降低，当柴油质量浓度为0.05 g/L时，降解率最高，然后逐渐下降。根据降解率曲线，柴油质量浓度小于0.05 g/L时，降解率应该会更高。

2.2 多噬香鞘氨醇单胞菌降解柴油的正交实验结果

多噬香鞘氨醇单胞菌降解柴油的正交实验结果见表4。根据表4计算极差R，按各实验因素对降解率影响由大到小排序，依次为D、A、B、C，且结果表明最佳实验条件为A2B2C2D1（结合表2，英文字母代表实验因素，数字代表实验水平），即0.1 g/L（1）的柴油浓度（D）、35℃（2）的培养温度（A）、pH值（B）为7（2）、叶轮转速（C）为220 r/min（2），此时理论上降解率最大，达80.12%。

表4 多噬香鞘氨醇单胞菌对柴油降解率的正交实验结果

Table 4 Orthogonal experimental results of Sphingomonas polyaromaticivorans on the degradation rate of diesel fuel

注: η%为降解率, 极差R = Eijmax-Eijmin

2.3 关于枯草芽孢杆菌共同降解柴油的讨论

合适的生物表面活性剂有助于微生物对油品的降解，它主要起到如下作用：1）微生物的细胞膜能够直接从表面活性剂包裹下的小油滴中吸收污染物质；2）微生物仅能吸收溶解于水相中的污染物质，表面活性剂仅起到了运输小油滴、分散大油团的作用；3）生物表面活性剂会改变微生物细胞膜的疏水性，促进微生物与呈液滴形态的石油污染物质直接接触^[11]。

鞘氨醇单胞菌特殊的外膜含一种鞘糖脂，其形成的疏水表面更利于胞外物质的摄取，有部分表面活性剂的功能，因而部分表面活性剂可能对鞘氨醇单胞菌对油品的降解不具有明显的效果。但是可能鉴于生物表面活性剂较好的环境相容性和较强的表面作用，相比化学表面活性剂，生物表面活性剂更能提高油品的降解效率。因此，枯草芽孢杆菌产生的表面活性剂在鞘氨醇单胞菌与枯草芽孢杆菌不产生竞争和吞噬的情况下，可能对鞘氨醇单胞菌对油品的降解作用能起到很好的促进作用。

对鞘氨醇单胞菌与枯草芽孢杆菌在石油降解中相互作用的实验设计大致如下：1）在优化的实验条件下，相同菌液量的对数期多噬香鞘氨醇单胞菌与枯草芽孢杆菌单独作用柴油培养液的实验。2）在优化的实验条件下，相同菌液量的对数期多噬香鞘氨醇单胞菌与枯草芽孢杆菌共同投放于柴油培养液的实验。3）将枯草芽孢菌液放入生物炭培养而后放入柴油培养液与相同菌液量的对数期多噬香鞘氨醇单胞菌共培养。据此判断，枯草芽孢杆菌产生的表面活性剂是否也能对鞘氨醇单胞菌对柴油的降解产生促进作用，是否对多噬香鞘氨醇单胞菌的生长有抑制作用，多噬香鞘氨醇单胞菌与枯草芽孢杆菌是否存在竞争甚至吞噬关系。

3 结语

影响鞘氨醇单胞菌对油品降解的外部因素主要有温度、振荡器转速、pH、石油污染物浓度、投菌量、表面活性剂等，多噬香鞘氨醇单胞菌在柴油浓度0.1 g/L，35℃，pH = 7.2，转速为220 r/min^-1时降解效果较好。鞘氨醇单胞菌与枯草芽孢杆菌共同降解油品的研究需进一步实验来分析论证，如果共降解对油品降解存在促进作用，对有效提高油品降解速率及扩大石油成分降解范围的研究都有积极的意义。

参考文献

[1] 潘金程, 李艳冰, 李晶, 等. 铜绿假单胞菌降解烃类污染物的泛基因组分析[J]. 应用与环境生物学报, 2021, 2(5): 1281-1288.

[2] 包清华, 黄立信, 修建龙, 等. 油气田含油污泥生物处理技术研究进展[J]. 化工进展, 2021, 40(5): 2762-2773.

[3] Atlas R M. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective. Microbiology Reviews, 1981, 45(1): 180-209.

[4] 李洲. 微生物对石油烃的降解机理研究[J]. 云南化工, 2018, 45(9): 179-180.

[5] 向廷生, 万家云, 蔡春芳. 硫酸盐还原菌对原油的降解作用和硫化氢的生成[J]. 天然气地球科学, 2004, 15(2): 171-173.

[6] BHARDWAJ G, CAMEOTRA S S, CHOPRA H K. Utilization of oil industry residues for the production of rhamnolipids by Pseudomonasindica[J]. Journal of Surfactants and Detergents, 2015, 18(5): 887-893.

[7] Parthipan P, Preetham E, Machuca L L, et al. Biosurfac tantanddegradative enzymes mediated crude oil degradation by bacterium Bacillus subtilis A1[J]. Frontiers in Microbiology, 2017(8): 193.

[8] Supaphol S, et al. These lection of mixed microbial inocula in environmental biotechnology Example using petroleum contaminated tropical soils[J]. Joumal of Microbiological Methods, 2006, 65: 432-441.

[9] Rahman K S M, et al. Towards efficient crude oil degradation by a mixed bacterial consortium[J]. Bioresource Technology, 2002, 85: 257-261.

[10]王卓颖, 王磊, 桂晓琳, 等. 高效降解机油微生物的筛选及除油效果初探[J]. 工业微生物, 2006, 36(1): 26-33.

[11]张瑶, 汤众. 柴油降解菌的筛选及降解柴油方法的研究进展[J]. 农产品加工, 2018(17): 66-67+70.

图2 柴油质量浓度对降解率的影响

Fig.2 Effect of diesel mass concentration on degradation rate