病毒性出血性败血症病毒（ VHSV）可视化核酸试纸条检测方法的建立-中国口岸科学技术-2024年04期

病毒性出血性败血症病毒（ VHSV）可视化核酸试纸条检测方法的建立

作者：殷培军金莹唐静岳志芹王宫璞房保海

殷培军金莹唐静岳志芹王宫璞房保海

摘要 本研究通过在病毒性出血性败血症病毒（Viral Haemorrhagic Septicaemia Virus，VHSV）的保守区5'端设计一对保守引物，在上游和下游引物的5'端分别修饰生物素（biotin）和异硫氰酸荧光素（FITC），成功建立了VHSV快速、可视化核酸试纸条检测方法。该方法具有高灵敏度，能够检测到33拷贝/μL的VHSV，比凝胶成像检测方法提高了10倍的灵敏度。实验结果证实该方法操作程序简便、反应迅速且灵敏，具备良好的特异性，可满足现场一线对于VHSV快速检测的需求，为流行病学调查及预防控制提供了新的方法学基础。

关键词 病毒性出血性败血症病毒（VHSV）；核酸试纸条；可视化检测

Establishment of a Visual Nucleic Acid Strip Test for Viral Haemorrhagic Septicaemia Virus

YIN Pei-Jun¹ JIN Ying¹ TANG Jing¹ YUE Zhi-Qin¹ WANG Gong-Pu¹ FANG Bao-Hai^1*

Abstract A rapid and visual nucleic acid test strip assay for Viral Haemorrhagic Septicaemia Virus (VHSV) was successfully established in this study. This was achieved by designing a pair of conserved primers at the 5' end of the conserved region of VHSV and modifying biotin and fluorescein isothiocyanate (FITC) at the 5' end of the upstream and downstream primers, respectively. The method has high sensitivity and is able to detect VHSV at 33 copies/μL, which is a 10-fold increase in sensitivity over the gel imaging detection method. The experimental results confirmed that the method had simple operating procedures, rapid response, sensitivity, and good specificity, which could meet the needs of the field for rapid detection of VHSV, and provided a new methodological basis for epidemiological investigation and prevention and control.

Keywords Viral Haemorrhagic Septicaemia Virus (VHSV); nucleic acid test strips; visual detection

病毒性出血性败血症病毒（Viral Haemorrhagic Septicaemia Virus，VHSV）属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）粒外弹状病毒属（Novirhabdo -virus）^[1]。该病毒于2006年5月从欧洲死亡的刺虾虎鱼身上首次被成功分离^[2]。该病毒对水生鱼类具有极高的致病性，严重危害大菱鲆鱼、茴鱼、褐鳟鱼、虹鳟鱼、白斑狗鱼和白鲑鱼等数十种鱼类，致死率高达90%～100%^[3]。由该病毒引起的病毒性出血性败血症（Viral Haemorrhaic Septicaemia，VHS）曾被世界动物卫生组织（World Organization for Animal Health，WOAH）列为必须申报的疫病，我国农业农村部也将其作为二类动物疫病进行管理^[4]。研究发现，VHSV基因组含有一段单链负股RNA，其线性基因组编码5个蛋白，包括糖蛋白（G蛋白）、RNA聚合酶（L蛋白）、2个结构蛋白（M1和M2蛋白）和核衣壳蛋白（N蛋白）^[4-5]；VHSV粒子直径约70 nm，长约180 nm，基因组长度约12000个碱基^[6-8]。

目前，国际上检测VHSV通常采用的方法是巢式RT-PCR法^[2]、细胞培养分离病毒法^[9]、血清学方法^[3,10-13]、实时荧光RT-PCR法^[9,14]、荧光环介导逆转录等温扩增^[15]等。巢式RT-PCR法通过扩增病毒RNA来检测病毒的存在，这种方法灵敏度高，但操作相对复杂，需要专业的技术人员及检测设备；细胞培养分离病毒法检测结果准确性高，但其检测周期相对较长，对实验人员操作能力要求较高，往往无法满足如今快速诊断的要求^[9]；血清学方法普遍检测费时费力，且用于大规模筛查时易受到其他病原体的干扰，导致出现假阳性结果，也难以满足当今快速检测的需求；Taqman探针实时荧光RT-PCR法比普通RT-PCR法以及细胞分离病毒法更加可靠，但随着病毒分离株的增加，发现使用的探针序列所在的VHSV-N区域变异较大，不能匹配部分分离株（如AB179621、DQ427105等），存在漏检的可能^[9]。因此，研究建立一种新型的VHSV通用型诊断方法，既满足一线快速诊断的需求，又解决VHSV漏检或假阳性的问题，对其开展日常疫情监控及其流行病学调查，进而制定实施有效的防治措施具有重要意义。

核酸检测试纸条技术就是通过在核酸引物或探针两端修饰生物素或荧光素等标记物，同时在试纸条上相应位置标记对应抗体，得以实现核酸产物的试纸条检测^[16-18]，该技术已经成熟应用于结核分枝杆菌^[19]、甲型H1N1病毒^[20-21]、外源基因EPSPS的检测^[22]。本研究通过在VHSV基因组的保守区5'端设计一对保守引物，建立了VHSV可视化核酸试纸条检测方法，通过对其反应条件进行优化，证实了该方法具有高选择性、高灵敏度和良好的生物兼容性。

1 材料与方法

1.1 病毒和细胞系

病毒性出血性败血症病毒（VHSV）RNA、鲤春病毒（Spring Viraemia of Carp Virus，SVCV）RNA和传染性造血组织坏死病病毒（Infectious Haematopoietic Necrosis Virus，IHNV）RNA。

1.2 试剂与仪器

ABI Proflex PCR仪购于ABI公司；PrimeScript^TM ONE STEP RT-PCR Kit Ver.2购于宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖购于美国Promega公司；DL2000 DNA marker购于天根公司；通用型核酸扩增物快速检测试纸条购于杭州优思达生物技术有限公司；RNA提取试剂盒（RNeasy Mini Kit，货号74106）购于QIAGEN公司。

1.3 引物设计和RT-PCR扩增

参照GenBank内VHSV全基因序列（AB672614.1、AB672618.1、AB672619.1、AB672620.1、AB839745.1、AB839746.1、D00687.1、AJ233396.1、FN665788.1、X73873.1、X73873.1、Z93412.2、AF012093.1、AF143862.1、AF143863.1、FJ460590.1、GQ325430.1、GQ325431.1、GU066860.1、KC468556.1），并用DNSTar进行序列比对，在VHSV基因组5'端保守区设计引物，引物序列为VHSV281-F（CAGGCKTTGTCYGTGCTTYT）（5'端标记FITC）和VHSV281-R（TCCCCRAGTTTYTTRGTGAT GTA）（5'端标记biotin），扩增长度为281 bp^[8]。

RT-PCR扩增参数：50℃ 30 min进行逆转录；95℃ 2 min；然后进行35次PCR循环（94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s循环）；72℃ 7 min；4℃保温。

1.4 PCR产物试纸条检测试验

取5 μL扩增产物滴加在试纸条的样品垫上，同时滴加2～3滴缓冲液，10 min后判读结果。试纸条上质控线出现红色条带，实验结果有效；检测线同时出现红色条带，结果判为阳性；检测线未出现红色条带，结果判为阴性。

1.5 VHSV核酸试纸条检测方法的灵敏度测试

将VHSV假病毒核酸用灭菌ddH₂O稀释至6.6 拷贝/μL、33 拷贝/μL、66 拷贝/μL、6.6×10² 拷贝/μL、6.6×10³ 拷贝/μL、6.6×10⁴ 拷贝/μL、6.6×10⁵ 拷贝/μL、6.6×10⁶ 拷贝/μL、6.6×10⁷ 拷贝/μL，再进行RT-PCR，扩增产物分别稀释，每个稀释梯度各取稀释后产物5 μL进行核酸试纸条检测、观察并记录结果。

1.6 实际样品的VHSV检测和灵敏度比较

采用RNA提取试剂盒QIAGEN RNeasy Mini Kit（74106）提取VHSV病毒RNA，将VHSV病毒核酸RNA用灭菌ddH₂O进行10×梯度稀释，再进行RT-PCR，扩增产物分别稀释，每个稀释梯度各取稀释后产物5 μL进行琼脂糖凝胶电泳和核酸试纸条检测，分别在凝胶成像系统、核酸试纸条上观察并记录结果。

2 结果及分析

2.1 VHSV试纸条检测结果

提取VHSV总RNA，经RT-PCR扩增后，将扩增产物滴加在试纸条的样品垫上检测，从图1结果可以看出，VHSV在检测带区域出现明显红色条带，而空白对照在检测带区域无红色条带。

2.2 核酸试纸条方法的特异性

用VHSV281-F和VHSV281-R引物对VHSV、SVCV、IHNV RNA进行RT-PCR扩增并进行核酸试纸条检测，从图2结果可以看出，只有VHSV扩增产物出现特异性红色条带，SVCV、IHNV和空白对照在检测线位置均无条带出现，显示了对VHSV良好的特异性。

2.3 核酸试纸条方法的灵敏度

提取并测定VHSV假病毒RNA的浓度，然后分别稀释成6.6 拷贝/μL、33 拷贝/μL、66 拷贝/μL、6.6×10² 拷贝/μL、6.6×10³ 拷贝/μL、6.6×10⁴ 拷贝/μL、6.6×10⁵ 拷贝/μL、6.6×10⁶ 拷贝/μL、6.6×10⁷ 拷贝/μL，经RT-PCR扩增后，用核酸试纸条进行检测，从图3结果可以看出，VHSV的核酸试纸条检测方法检测限可以达到33 拷贝/μL。

2.4 实际样品的VHSV检测和灵敏度比较

采用RNA提取试剂盒QIAGEN RNeasy mini kit（74106）提取VHSV病毒RNA，进行10倍梯度稀释至10⁹倍，进行RT-PCR，分别用核酸试纸条法和凝胶成像法进行检测，从图4结果可以看出，实际样品的VHSV核酸试纸条法检测可以达到10⁸稀释倍数；从图5结果可以看出，实际样品的VHSV凝胶成像法检测可以达到10⁷稀释倍数。从而可以得出，VHSV的核酸试纸条法比凝胶成像法灵敏度高出10倍。

3 结论和讨论

本研究建立了一种将一步法逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）与核酸试纸条检测方法相结合的核酸试纸条可视化检测VHSV的方法，该方法省略了凝胶电泳检测RT-PCR扩增产物所需要的制胶、电泳、成像等步骤，将2 h的检测时间缩短为10 min左右，极大提高了检测效率并能够实现裸眼判读^[8,16-17]；灵敏度试验结果表明VHSV核酸试纸条法的检测灵敏度比传统电泳凝胶成像法高出至少10倍；同时该方法检测完后只产生少量的纸质垃圾，处理简单，避免了使用溴化乙锭等核酸染色剂对环境的污染，降低了交叉污染的可能性^[8,17-18]。

VHSV可视化核酸试纸条检测法不仅操作方便、特异性强、灵敏度高，而且检测时间短、效率高、结果直观、稳定、准确，适合目前海关实验室进行VHSV的快速筛查，另外也可广泛应用于PCR诊断试剂的开发。本方法的建立为VHSV的流行病学调查及预防控制提供了新的方法学基础，进而为食品安全监管提供技术支持与保障。

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基金项目：国家重点研发计划（2021YFF0602803）

第一作者：殷培军（1979—），男，汉族，山东青岛人，硕士，高级农艺师，主要从事微生物检测工作，E-mail: yinqaz309@126.com

通信作者：房保海（1976—），男，汉族，山东临沂人，博士，研究员，主要从事水生动物检疫和食品安全研究工作，E-mail: fbh_mail@163.com

1. 青岛海关技术中心青岛 266109

1. Technology Center of Qingdao Customs District, Qingdao 266109