登革病毒胶体金抗体检测试剂盒的研发-中国口岸科学技术-2024年05期

登革病毒胶体金抗体检测试剂盒的研发

作者：杨森刘迪冯茹荔李桂梅刘万建滕新栋

杨森刘迪冯茹荔李桂梅刘万建滕新栋

摘要 为建立一种检测登革病毒（Dengue virus，DENV）的胶体金抗体检测试纸条，进行抗原序列选择和同源性分析，选择特异性较高的登革病毒非结构蛋白1（Non-structural protein，NS1）检测抗体的特异性抗原，并对其特异性、灵敏性、重复性、稳定性、抗干扰性和抗破坏性进行了测试。结果显示：制备的胶体金抗体检测试剂纸条的特异性和干扰试验均符合产量质量要求，与圣路易斯脑炎病毒（St. Louis encephalitis virus，SLEV）、西尼罗河病毒（West Nile virus，WNV）、日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、黄热病病毒（Yellow fever virus，YFV）无交叉反应，试剂盒不受甘油三酯、胆红素等血清基质的影响，在37℃保存1个月后，仍可以达到产品的质量标准要求，同时具有较好的灵敏性。结果表明，本研究成功制备了一种快速检测登革病毒的胶体金抗体检测试纸条，具有特异性、灵敏性、重复性、抗干扰性和抗破坏性强等特点，为登革病毒检测提供了有力的工具。

关键词 胶体金；抗原制备；检测

Development of Colloidal Gold Antibody Detection Kit for Dengue Virus

YANG Sen^1,2 LIU Di² FENG Ru-Li² LI Gui-Mei¹ LIU Wan-Jian³ TENG Xin-Dong^2*

Abstract To establish a colloidal gold antibody test strip for detecting dengue virus (DENV), we conducted antigen sequence selection and homology analysis. Subsequently, we specifically selected the specific antigen of dengue virus non structural protein 1 (NS1) with high specificity for antibody detection. We then conducted tests to evaluate its specificity, sensitivity, repeatability, stability, anti-interference and anti-destruction properties. The results showed that the specificity and interference test of the prepared colloidal gold anti physical examination test agent strip met the requirements of yield and quality, and there was no cross reaction with St. Louis encephalitis virus (SLEV), West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis virus (JEV), or yellow fever virus (YFV). Furthermore, the kit was not affected by serum matrix such as dry triglyceride and bilirubin. Even after being stored at 37℃ for 1 month, it still met the product quality standards, demonstrating good sensitivity. The study successfully developed a colloidal gold antibody test strip for the rapid detection of dengue virus, characterized by specificity, sensitivity, repeatability, anti-interference and anti-destruction properties, providing a powerful tool for the detection of dengue virus.

Keywords colloidal gold; antibody preparation; detection

基金项目：山东省重点研发计划（重大科技创新工程）（2021CXGC011306）

第一作者：杨森（1999—）男，汉族，河北石家庄人，硕士，主要从事预防兽医学研究工作，E-mail: 1549787281@qq.com

通信作者：滕新栋（1987—）男，汉族，山东青岛人，博士，副主任技师，主要从事病原生物学研究工作，E-mail: tengxindeng@163.com

1. 青岛农业大学青岛 266109

2. 青岛国际旅行卫生保健中心（青岛海关口岸门诊部）青岛 266071

3. 青岛汉唐生物科技有限公司青岛 266000

1. Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109

2. Qingdao International Travel Health Center (Port Outpatient Department of Qingdao Customs), Qingdao 266071

3. Qingdao Hantang Biotechnology Co., Ltd., Qingdao 266000

登革病毒（Dengue virus，DENV）作为一种新型的蚊媒传染病病毒，在全世界有着较高的发病率^[1]。DENV传播广泛，容易引起大规模的流行暴发以及跨区域传播^[2]。DENV感染后会引起发热、头痛、恶心、呕吐以及白细胞减少等症状。DENV感染是热带和亚热带地区疾病的主要原因，DENV主要流行于非洲、亚洲、美洲地区，每年约1.3亿人感染，对人类健康和社会经济发展构成了威胁。

胶体金，又称胶体纳米金，是一种新型免疫学检测技术，具有操作简单、特异性强、生产成本低、无须专用仪器等优点^[4]，具有在短时间内定性检测相关病毒的潜力，以及所需的灵敏度和准确性，有效解决了传统检测方法在医疗、兽医、动物、植物病毒检测、农药残留检测等领域检测时间长、设备不便、专业性要求高的问题。目前，该技术已在细菌性疾病、病毒性疾病的检测及传染病预防等方面得到应用^[5]。

本研究利用胶体金免疫层析技术制备了快速检测DENV的抗体检测试纸条，并对其检测效果进行评价，为DENV快速诊断和防控提供了有力工具。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

PCR仪、二氧化碳培养箱、脂质体转染试剂购自赛默飞世尔科技公司；恒温培养箱、超净工作台购自上海博迅实业有限公司；细胞培养瓶、6孔板、酶标板购自康宁生物科技有限公司；胰酶、磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）、G418购自北京索莱宝科技有限公司；Ni-IDA-Bestarose 6 FF亲和层析柱购自博格隆生物技术有限公司；大肠杆菌Dh5α菌株购自天根生化科技(北京)有限公司；pCDNA-3质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司、2019-nCoV-S由山东大学馈赠；BamHⅠ、XhoⅠ等酶类购自TaKaRa宝生物工程有限公司、酵母粉、蛋白胨等试剂购自国药集团药业股份有限公司；100份DENV血清样本由青岛国际旅行卫生保健中心（青岛海关口岸门诊部）实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 抗原制备

在NCBI（http://www. ncbi.nlm.nih.gov）上进行抗原序列选择和同源性分析，选择特异性较高DENV的非结构蛋白1（Non-structural protein 1，NS1）蛋白进行抗原制备，根据文献检索及分析结果^[6]，选取无信号肽，无跨膜结构域，整体亲水性，抗原表位丰富区，之后进行重组载体的构建以及蛋白表达纯化与鉴定。

1.2.2 胶体金制备与蛋白标记

采用柠檬酸钠还原法制备胶体金，以DENV重组抗原和生物素化的BSA进行胶体金标记，采用速度离心法纯化胶体金标记后的蛋白。按照日常经验值10∶1浓缩，10%比例固定于玻璃纤维上。

1.2.3 硝酸纤维素膜的制备与试纸条的组装

选取鼠抗人IgM单抗、鼠抗人IgG单抗及链霉亲和素，分别划线作为试纸的检测线（T2、T1）和质控线（C），分别按照0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL 3种不同浓度下进行硝酸纤维素膜的包被，并组装胶体金试纸条进行测试。

1.2.4 样本稀释液的制备

根据试验要求，制备样本稀释液，生理盐水、15 mmol/L PBS缓冲液、20 mmol/L PBS缓冲液，分别滴加于试纸条上，平行检测10次，从膜面层析速度、条带显色、背景底色、有无假阳性等方面对稀释液进行研究。

1.2.5 血清基质干扰试验

临床检验中，样本中常见的干扰物质如甘油三酯、胆红素，易对检测结果产生干扰。经临床机构收集，同时参考卫生行业标准WS/T 416—2013《干扰实验指南》，得出每种物质人体内潜在的最大浓度，以此浓度为基准进行研究。甘油三酯人体内最大浓度约为63.10 mmol/L，在收集到的IgM/IgG抗体阴性、弱阳性样本中分别添加甘油三酯64.0 mmol/L、36.0 mmol/L、24.0 mmol/L、12.0 mmol/L、6.0 mmol/L、3.0 mmol/L、1.0 mmol/L，胆红素1000 μmol/L，验证是否对检测结果产生干扰。

1.2.6 巯基乙醇破坏试验

2-巯基乙醇能将-S-S-键还原成-SH，破坏了IgM/IgG结构，从而使其失去活性。选取DENV IgM/IgG抗体阳性血清样本5例，将血清阳性样本分成试验组和对照组，试验组中加入等量0.2 mol/L 2-巯基乙醇，对照组中加入等量PBS，同时置于37℃作用1 h。

1.2.7 特异性试验

应用圣路易斯脑炎病毒（St. Louis encephalitis virus，SLEV）、西尼罗河病毒（West Nile virus，WNV）、日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、黄热病病毒（Yellow fever virus，YFV）进行特异性验证分析，样本来源均为感染者血清样本。

1.2.8 加速稳定性试验

将试纸条进行密封，加干燥剂存放于37℃，每隔１周检测１次，测试其稳定性，共检测6次，同时设立常温放置对照组。

1.2.9 灵敏性试验

DENV阳性样本的滴度约为1/8000（Ig/G）和1/2000（Ig/M），按照倍比稀释方法，将DENV阳性样本原液稀释1倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍共5个浓度梯度，用本试验研制的DENV胶体金抗体检测试纸条检测上述样品，检测得到最高的稀释倍数即为自研试剂盒的灵敏度。

1.2.10 重复性试验

取DENV阳性样本，用本试验研制的DENV胶体金抗体检测试纸条检测上述样品，每个样品重复检测5次，以自制色卡为参考，分析相同样本的显色差异，以评价自研试剂盒的检测的重复性。

1.2.11 临床样本检测

利用本试验研制DENV胶体金抗体检测试纸条对100份疑似DENV临床血清样本进行检测，同时以SN/T 2301—2009《国境口岸登革病毒的实时荧光RT-PCR快速检测方法》^[7]所建立的荧光定量逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription-Polymerase chain reaction，RT-PCR）检测方法为对照，以评价自研试剂盒的检测准确率。

2 结果与分析

2.1 硝酸纤维素膜的制备与试纸条的组装

结果显示：原料的包被浓度在0.4 mg/mL时，阳性样本、阴性样本检测结果均符合要求，进一步提高包被浓度，阴性样本检测结果出现假阳性，说明包被浓度为0.4 mg/mL试剂灵敏度和特异性较好，是适宜的包被浓度。

2.2 样本稀释液的制备

制备3种样本稀释液，生理盐水、15 mmol/L PBS缓冲液、20 mmol/L PBS缓冲液，分别滴加于试纸条上，平行检测10次，从膜面层析速度、条带显色、背景底色、有无假阳性等方面对稀释液进行研究。结果显示：20 mmol/L PBS缓冲液结果符合要求且最优，可作为样本稀释液。

2.3 血清基质干扰验证

结果显示：甘油三酯浓度为6.0 mmol/L或低于此浓度时，胆红素浓度为1000 μmol/L或低于此浓度时，对检验结果无干扰，不影响最终结果判读，可用作样本检测。

2.4 巯基乙醇破坏试验

结果显示：经过2-巯基乙醇处理含有IgM/IgG抗体的样本，抗体的检测结果由阳性转为阴性，从而影响了结果的判读，因此在整个试纸条制备和检测过程中不允许有巯基乙醇的存在。

2.5 特异性验证

结果显示：本试剂与圣路易斯脑炎病毒（St. Louis encephalitis virus，SLEV）、西尼罗河病毒（West Nile virus，WNV）、日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、黄热病病毒（Yellow fever virus，YEV）不发生交叉反应，表明本试验研制的试纸条具有较好的特异性。

2.6 加速稳定性试验

结果显示：用铝箔袋密封的胶体金成品试纸条，在37℃保存1个月后，仍可以达到产品的以上性能指标，而且结果与对照组无显著差异，表明试纸条的加速稳定性试验较好。

2.7 灵敏性试验

结果显示：将DENV阳性样本原液进行倍比稀释，稀释100倍时试纸条T1和T2检测线为阳性，稀释1000倍时试纸条T1和T2检测线为阴性，DENV 样本原液稀释10倍时即为本试剂的检测灵敏度。

2.8 重复性试验

结果显示每个样本显色无显著差异，表明本试验研制的试纸条具有较好的重复性。

2.9 临床样本检测

结果显示：应用本试验研制试剂盒与荧光定量RT-PCR方法分别对100份疑似DENV临床血清样本进行检测，均检出4份DENV-2型阳性样本，DENV阳性率为4%（4/100），两种方法的符合率为100%，表明本试验所研发的试剂盒具有较好的检测能力。

3 讨论

登革病毒（DENV）是登革热的病原体，主要通过雌性的埃及伊蚊传播^[8]，属于黄病毒科黄病毒属，为单股正链RNA病毒^[9]。根据其抗原差异，可以将DENV分为4种不同的亚型，分别为DENV-1、DENV-2、DENV-3和 DENV-4^[10]，感染4种血清型中的任何一种都会导致危及生命的出血热和休克等症状的出现，尽早诊断DENV对于预防该病至关重要^[11]。目前，针对DENV 的检测主要包括病毒分离、抗原抗体检测、分子生物学检测等^[12]。其中，利用胶体金免疫层析快速试验检测DENV抗原和抗体，具有操作简便、价格相对低廉、无须专用仪器、无须特殊培训、检测结果直观和现场使用方便等优点，在基层实验室得到了广泛应用和推广^[13]。

胶体金免疫层析技术主要分为抗原和抗体检测两种类型^[14]，其原理是利用吸水垫形成的毛细管虹吸效应，使被检测抗原或抗体等分析物与胶体金标记的抗体或抗原成胶体金标记复合结合物，如果样品分析物中含有被检测的抗原或抗体，样品沿着吸水纸方向泳动至T线与包被的抗原或抗体发生反应，泳动至C线与包被的抗原或抗体也发生反应。若C线显色，证明结果有效；若不显色，则无效，需重新检测^[15]。该项技术主要分为夹心法、竞争法和间接法三大类^[16]。夹心法主要用于大分子物质检测，通过对胶体金标记抗体的竞争实现检验效果^[17]。竞争法主要用于检测小分子抗原，这些小分子抗原不能直接固定在硝酸纤维素膜上，因此需要将其偶联到BSA等大分子物质上后再固定到硝酸纤维素膜上^[18]。间接法适用于血清中抗体水平的检测，以此判定机体内是否存在该病原的特异性抗体，达到检测病原的目的^[19]。本研究根据DENV的NS1蛋白进行抗原的制备，研发了DENV胶体金抗体检测试纸条，经试验验证，该检测试纸条特异性、稳定性好，抗干扰、抗破坏能力强，应用自研试纸条与荧光定量RT-PCR方法分别对100份疑似DENV临床血清样本进行样本检测，结果显示，两种方法均检出4份DENV-2型阳性样本，两者符合率为100%，表明本试验研制的试剂盒具有良好的检测效果

综上所述，本研究所研发的胶体金抗体检测试剂盒可用于对DENV的检测，为预防和控制该疾病提供了有效的工具。

参考文献

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