林诗颖 彭晓丽 曾志昌 黄恩炯

摘 要 本研究以ITS2基因为分子标记设计杂交探针，制作DNA芯片鉴定杂鳞库蚊复合组、白纹伊蚊亚组和尖音库蚊复合组中的8种/亚种蚊虫。结果表明，以ITS2基因为分子标记设计的DNA芯片可用于3个复合组（亚组）组间蚊虫以及杂鳞库蚊复合组的组内蚊虫鉴定，且白纹伊蚊亚组探针、尖音库蚊复合组探针、杂鳞库蚊复合组探针、三带喙库蚊探针、伪杂鳞库蚊探针、致倦库蚊探针、尖音库蚊探针具有良好的专一性和特异性。现场测试表明，该DNA芯片可应用于识别不同发育阶段和不同地区的同种蚊虫，但对尖音库蚊和致倦库蚊表现出非专一性杂合。

关键词 蚊虫；复合组（亚组）；DNA芯片；鉴定

Preliminary Study on the Identification Technology of Mosquito Complexes Using DNA Chip

LIN Shi-Ying ^1,2 PENG Xiao-Li ¹ ZENG Zhi-Chang ³ HUANG En-Jiong ^1*

Abstract This study employed the ITS2 gene as a molecular marker for the design of hybridization probes, creating a DNA chip for the identification of eight species/subspecies within the Cules vishnui complex, Aedes albopictus subgroup, and Cx. pipiens complex. The findings indicate that the DNA chip, developed with the ITS2 gene as the molecular marker, is suitable for the inter-complex (subgroup) and intra-complex identification of mosquitoes, including those within the Cx. vishnui complex. The probes specific to the Ae. albopictus subgroup, Cx. pipiens complex, Cx. vishnui complex, Cx. tritaeniorhynchus, Cx. pseudovishnui, Cx. quinquefasciatus, and Cx. pipiens displayed high specificity and selectivity. Field assessments have confirmed the applicability of the DNA chip in identifying conspecific mosquitoes at different developmental stages and from diverse regions. However, the chip exhibited non-specific hybridization for Cx. pipiens and Cx. quinquefasciatus.

Keywords mosquitoes; complexes (subgroups); DNA chip; identification

蚊虫是重要的病媒生物，其危害不仅在于刺叮吸血，而且是黄热病、登革热/登革出血热、疟疾和流行性乙型脑炎等传染病的传播媒介，严重危害人类健康。目前大多数蚊媒传染病尚无疫苗或特效药。因此，对蚊虫的鉴定和识别是监测与控制蚊媒病发生的基础。

DNA芯片又叫基因芯片，也是以分子生物学为基础发展而来的一种可用于分子鉴定的技术，其综合了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术的高效性、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）的可靠性以及分子鉴定方法所需DNA量小等优点，利用专一性探针和标记的靶标产物，通过一系列的呈色反应快速鉴定物种，是一种灵敏度高、专一性强的高通量检测技术，是目前生物芯片中研究应用最为广泛的一种。

DNA芯片最早用于测序，利用固定的探针与生物样品的靶序列进行分子杂交，得到特定的杂交图谱，进而分析出待测样品的序列，因此被称为杂交测序^[1]。赵明等^[2]通过DNA条形码信息研制虚拟DNA芯片，成功鉴定15种蚊虫，在理论上证明了DNA芯片在口岸检验检疫中推广应用的可能性。此外，DNA芯片在食蝇、检疫性蚜虫和蓟马等害虫的鉴定方面也取得了一定进展^[3-5]。之后，研究人员采用DNA芯片对9种常见蚊虫进行鉴定，结果表明DNA芯片具有高灵敏度和专一性，可快速准确地鉴定实验蚊虫，但对于复合组蚊虫的准确识别仍存在一定困难^[6]。本研究以ITS2为靶标基因研制DNA芯片，探讨DNA芯片在白纹伊蚊亚组（白纹伊蚊、伪白纹伊蚊）、杂鳞库蚊复合组（三带喙库蚊、伪杂鳞库蚊）和尖音库蚊复合组（骚扰库蚊、尖音库蚊、淡色库蚊和致倦库蚊）鉴定中的应用前景。

1 材料与方法

1.1 供试蚊虫

用于DNA芯片研发的三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）、伪杂鳞库蚊（Cx. pseudovishnui）、致倦库蚊（Cx. quinquefasciatus）、白纹伊蚊（Aedes albopictus）和伪白纹伊蚊（Ae. pseudalbopictus）采自福建，尖音库蚊（Cx. pipiens）采自新疆。淡色库蚊（Cx. pallens）由大连国际旅行卫生保健中心（大连海关口岸门诊部）惠赠，骚扰库蚊（Cx. molestus）为实验室之前固定于酒精中的样本。验证蚊虫样本主要采自福建的福州、长乐、福清、平潭、惠安、涵江等地。同时采集成蚊和幼虫，幼虫带回实验室羽化后进行实验。蚊虫参照《中国动物志 昆虫纲 第八卷 双翅目：蚊科》^[7]进行种类鉴定，鉴定后由权威专家进行复核。确定蚊种后固定于75%酒精并保存于-20℃冰箱，用于后续的分子生物学实验。

1.2 蚊虫基因组DNA提取及扩增

根据试剂盒说明书分别提取单只目标蚊虫的基因组DNA，PCR扩增COⅠ、ITS2及Cytb基因片段，扩增引物及扩增体系参照林诗颖等^[8]的研究进行设计。将扩增片段送至生工生物工程（上海）有限公司测序。

1.3 探针设计筛选

根据8种蚊虫COⅠ、ITS2及Cytb基因序列相似度，取各个虫种之间序列差异较大区域作为设计探针的对象^[9]。设计探针时需注意^[10]：探针间Tm值接近；探针序列最优长度设置在25～30 bp之间；GC含量占40%～60%；4种碱基均匀分配；排除可形成发卡结构的寡核苷酸；探针不与非靶序列互补。

1.4 芯片制作

1.4.1 PCR产物纯化及变性

将PCR产物纯化后，取0.5 µL电泳检测回收过程中是否有DNA丢失。将扩增产物变性处理，使得双链DNA解链成单链DNA。DNA双链的变性过程：95℃热变性5 min，冰浴2～3 min，将纯化及变性后的产物低温保存，用于芯片杂交实验。

1.4.2 芯片孵育

取7 µL氨基修饰的探针液，加入相同体积的纯水与点样液混匀后依次移至 384 孔板中。使用SmartArrayer^TM-48点样仪进行点样。将点好样的芯片放置湿盒中，加入1～2 mL的无菌水，37℃下孵育12 h以上。

1.4.3 芯片固定

取出孵育过夜的基因芯片，放入盛有20 mL 0.2% SDS清洗液的盒子中，在摇床上以75 rpm速度清洗5 min。清洗完毕后，取出芯片放入盛有40 mL无菌水的盒子中，在摇床上以110 rpm速度清洗3 min，等待封闭。

1.4.4 芯片封闭

称取0.5 g硼氢化钾加入15 mL的1×PBS，摇晃至完全溶解，再加入5 mL无水乙醇混匀。将芯片放入上述封闭液中，在摇床上以75 rpm速度清洗5 min。封闭结束后，取出芯片在摇床上以110 rpm清洗3 min，离心甩干。

1.4.5 芯片杂交

将贴好的围栏芯片放入杂交盒内，点有探针的一面朝上，杂交盒内预先加入1 mL蒸馏水，盖上盖玻片，缓慢加入20 µL杂交液，盖紧。放入BioMixer^TMⅡ芯片杂交清洗仪中，42℃，杂交4 h。杂交液体系按表1进行配制。

表1 杂交液体系配制

Table 1 Hybridization solution system configuration

杂交结束后，将芯片移至芯片清洗仪中，先后用42℃洗液Ⅰ（0.3×SSC，0.1% SDS）、洗液Ⅱ（0.06×SSC）清洗4 min，离心甩干。

1.4.6 芯片扫描

将清洗后的芯片载入LuxScan^TM10K微阵列芯片扫描仪，选择扫描区域，点击“红光通道”调整PMT参数至670后，再进行扫描并保存扫描图案。

1.4.7 结果判读

经PCR扩增而修饰上荧光基团的目的片段与固定在DNA芯片上的探针进行特异性结合后，洗去未杂合的DNA再将之显色，以光信号发出的位置来判断蚊虫的种类。

1.5 芯片的验证

1.5.1 不同发育阶段蚊虫测试

采用致倦库蚊的幼虫、蛹以及成蚊验证所建立的DNA芯片鉴定技术是否适用不同发育阶段蚊虫的鉴定。

1.5.2 野外蚊虫样本随机测试

野外采集的成蚊形态学鉴定后，固定于99%酒精中，用于测试芯片的灵敏度和特异性。

2 结果

2.1 探针的设计与筛选

根据短寡核苷酸探针的设计原则，4个不匹配是探针尺寸允许的最大数量^[11]，本研究通过比对共设计出12条探针，分别为区分白纹伊蚊亚组、尖音库蚊复合组和杂鳞库蚊复合组的3条组间探针、8条组内蚊虫探针以及1条阳性探针。为提高杂交效率，探针的5'端进行氨基修饰，同时5'端加6个C碱基。以ITS2为靶基因的通用引物在上游引物标记Cy5荧光基团。引物和探针由生工生物工程（上海）有限公司合成，具体引物和探针序列见表2。

2.2 点阵设计

点样芯片选用博奥生物集团有限公司的醛基芯片，探针的点样浓度为30 µM，点阵选择12个小围栏分布方式（图1）。设置软件Personal Arrayer中的点样步骤，最后采用SmartArrayer^TM-48型点样仪进行接触式点样。

图1 探针在基因芯片上的点阵分布

Fig.1 Array distribution of probes on the DNA chip

芯片上12个点阵设计完全相同，每个点阵排列方式8×9，除外标和空白对照以外，每个探针重复4次。其中，第一行AI-AIX和第一列AI-HI为外标，HII-HIX为阴性对照（空白点样液），其余分别为各组蚊虫ITS2探针。外标和阴性对照用于检测芯片质量是否合格以及反应条件是否正常，以保证结果的有效性。在正常实验条件下，阳性对照组的样点有荧光信号，阴性对照组则没有。此外，外标探针还能起到位置标记的作用。点阵的排布方式如图2所示。

2.3 芯片研发

用柱式法提取白纹伊蚊、伪白纹伊蚊、淡色库蚊、致倦库蚊、骚扰库蚊、尖音库蚊、三带喙库蚊及伪杂鳞库蚊的基因组DNA，以提取的核酸为模板进行ITS2基因的PCR扩增，每种蚊虫PCR的纯化产物与杂交液组成单个杂交体系，与制备的DNA芯片进行杂交。由于分子间结合的强弱导致靶分子的数量存在差异，因此芯片的扫描结果呈现出颜色不一的信号。白色和红色的荧光信号均提示有靶分子结合。白色荧光信号是过曝的表现，提示结合了大量的靶分子；红色荧光信号颜色越浅，提示靶分子结合的数量越少。芯片的杂交信号结果如图3所示。

探针的测试结果显示：外标探针均有信号发出，提示芯片杂交正常。除骚扰库蚊和阴性对照外，其余的蚊虫均有相应探针讯号出现。

Aal S-ITS2: 白纹伊蚊亚组探针; Cpi C-ITS2:尖音库蚊复合组探针; Cvi C-ITS2: 杂鳞库蚊复合组探针; Aal-ITS2: 白纹伊蚊探针; Aps-ITS2: 伪白纹伊蚊探针; Cpa-ITS2: 淡色库蚊探针; Cqu-ITS2: 致倦库蚊探针; Cmo-ITS2: 骚扰库蚊探针; Cpi-IS2: 尖音库蚊探针; Ctr-ITS2: 三带喙库蚊探针; Cps-ITS2:伪杂鳞库蚊探针; N-ITS2: 阳性对照组探针; Em: 外标探针; Blank: 空白对照

图2 基因芯片探针布局

Fig.2 Layout of probes on the DNA chip

2.4 芯片的初步验证

2.4.1 不同发育阶段蚊虫验证结果

芯片验证结果显示在探针的位点上均有信号发出（图4），位置与图3D一致，可判定为致倦库蚊，表明该芯片适用于不同发育阶段致倦库蚊的鉴定。

2.4.2 野外随机样本杂交结果

1）非目标蚊种。芯片杂交结果如图5所示，其中非目标蚊虫共计6属12种，且仅有外标和阳性位点有杂交信号发出，提示可用于区分目标蚊虫和非目标蚊虫。

2）杂鳞库蚊复合组。芯片杂交结果显示三带喙库蚊和伪杂鳞库蚊探针在相应的位点有专一信号（图6），提示该芯片可用于鉴定杂鳞库蚊复合组中的供试蚊虫。

3）尖音库蚊复合组。尖音库蚊复合组芯片杂交结果如图7所示，致倦库蚊探针和尖音库蚊探针具有专一性，而淡色库蚊探针与尖音库蚊样本出现非专一性结合，提示淡色库蚊探针特异性不强。

4）白纹伊蚊亚组。福建省内不同地区白纹伊蚊和伪白纹伊蚊芯片鉴定结果如图8所示，结果提示芯片杂交结果稳定。

3 讨论

目前蚊虫控制依旧是蚊媒病预防和控制的重要措施，而蚊虫种类识别是进行有效防控的必要前提和基础。传统的蚊虫形态学分类主要通过其外部特征进行鉴定，存在以下弊端：一是耗时费力，且易受到遗传可变性和表型可塑性等因素的影响；二是品种鉴定依赖于经验丰富的技术人员；三是对于外部形态差异细微的蚊虫复合组，难以通过外部形态进行鉴定。以尖音库蚊复合组为例，需要解剖雄性外生殖器明确其阳茎侧板中叶形态特征才能对复合组内的亚种进行准确识别^[12]。因此，传统的形态学分类方法已不能满足目前的蚊虫鉴定需求。

与传统PCR鉴定技术不同，DNA芯片鉴定可通过肉眼观察成色反应，更加精确直观地进行蚊种鉴定。另外，有研究发现DNA芯片检测的灵敏度至少是PCR的10倍^[3]，表明DNA芯片鉴定仅需要极少的组织，剩余样本仍然适合进行形态学鉴定及保存作为凭证样本。利用DNA芯片鉴定蚊虫是一种准确快速的高通量技术，其中专一性寡核苷酸探针的设计尤为关键。本研究兼顾了探针设计的Tm值、GC含量，以及与非靶序列总体序列的相似性，共设计出12条探针。在设计白纹伊蚊探针和伪白纹伊蚊探针时，由于两者的ITS2基因序列相似度高达99%，序列间差异极小，在筛选专一性探针时存在困难。有研究表明使用寡核苷酸探针与非靶序列的总体序列相似性应小于75%，并在稳定的杂交条件下小于14个连续互补碱基对具有基因特异性^[13]，而白纹伊蚊和伪白纹伊蚊探针无法满足该特性，在芯片验证时出现严重的非专一性结合。另外，尖音库蚊复合组的准确鉴定一直以来都是重要且高难度的工作，本研究中尖音库蚊复合组ITS2序列相似性高达96%～99%，选择序列差异较大的片段设计出4条尖音库蚊复合组的特异性探针，但受骚扰库蚊样本核酸问题的影响，暂未完成对骚扰库蚊的芯片测试，初步测试结果显示其余3种蚊虫的芯片在相应的位点均有专一信号发出，提示可应用于后期野外的芯片验证。

芯片鉴定结果显示致倦库蚊3个发育阶段的测试结果均相同，与之前的报道^[6]结果一致，提示该芯片可应用于不同发育阶段的蚊种鉴定。非目标蚊种共选用6个属12种蚊虫进行芯片测试，芯片上仅出现ITS2的阳性对照点，说明该DNA芯片对目标蚊虫有着极强的专一性，且仅能识别白纹伊蚊亚组、尖音库蚊复合组以及杂鳞库蚊复合组蚊虫。白纹伊蚊野外随机样本杂交结果显示，5个不同地区的白纹伊蚊芯片杂交结果相同，在白纹伊蚊亚组探针、白纹伊蚊探针、伪白纹伊蚊的位点上均有信号发出。尖音库蚊复合组中的尖音库蚊和致倦库蚊杂交结果显示淡色库蚊探针出现非专一性杂合，主要原因可能与淡色库蚊的探针缺乏特异性有关。这主要是由于尖音库蚊复合组间的序列高度相似难以进行探针设计所引起。该现象还可能与我国尖音库蚊种内亚种间和亚种内的变异^[14]以及各亚种间存在相互杂交有关^[15]。

实际上，探针设计的特异性问题需要权衡特异性与灵敏度。有研究表明探针长度对芯片的灵敏度和特异性存在影响，在相同条件下，长度为60 bp的寡核苷酸探针的灵敏度平均比25 bp的寡核苷酸探针高7倍^[16]，而特异性低于25 bp的寡核苷酸探针^[17]，即灵敏度和特异性之间呈反比关系。此外，在今后的复合组鉴定中可以尝试加入新的分子标志物，如乙酰胆碱酯酶基因^[18]，提高芯片鉴定的准确性，为复合组蚊虫的鉴定提供新的思路。

进一步分析实验中出现的探针点模糊成片以及杂交信号强弱不均衡等问题发现：探针点模糊成片可能与探针点样时的温湿度有关，或受芯片固定时的反应和气密性的影响。另外，杂交信号的荧光强度不仅与探针结合靶分子的量的多少有关^[19]，还与不同探针之间结合能力差异存在关联。有研究表明寡核苷酸探针与靶基因的不同区域结合会产生不同的信号强度^[20]，例如针对给定的生物体的16S rRNA基因不同区域的探针信号强度可能相差240倍，这也解释了本实验中芯片杂交信号强弱的问题。

4 结论

本研究以ITS2为分子标记研发的DNA芯片用于鉴定杂鳞库蚊复合组、白纹伊蚊亚组和尖音库蚊复合组组间以及杂鳞库蚊复合组的组内蚊虫，芯片具有较好的重复性及稳定性。另外，对于准确区分白纹伊蚊亚组以及尖音库蚊复合组的组内蚊虫的问题，有待后续进一步寻找新的靶基因，完善探针设计。

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基金项目：福建省对外科技合作项目（2020I0031）；福州海关科研项目（FK2021-05）

第一作者：林诗颖（1996—），女，汉族，福建宁德人，硕士，主要从事疾病预防控制相关工作，E-mail: 1254667842@qq.com

通信作者：黄恩炯（1981—），男，汉族，福建晋江人，博士，主任技师，主要从事病媒生物控制相关工作，E-mail: enjiong@163.com

1. 福州国际旅行卫生保健中心 福州 350001

2. 福建医科大学公共卫生学院 福州 350122

3. 榕城海关综合技术服务中心 福清 350301

1. Fuzhou International Travel Health Care Center, Fuzhou 350001

2. The School of Public Health, Fujian Medical University, Fuzhou 350122

3. Comprehensive Technology Service Center, Rongcheng Customs, Fuqing 350301

表2 基因芯片检测探针序列

Table 2 Sequence of detection probes for the DNA chip

幼虫

蛹

成蚊

图4 致倦库蚊不同发育阶段芯片测试结果

Fig.4 DNA chip test results for different developmental stages of Cx. quinquefasciatus

A

B

C

D

E

F

A、D～F: 伪杂鳞库蚊复合组; B、C: 三带喙库蚊

图6 杂鳞库蚊复合组蚊虫芯片杂交结果

Fig.6 Hybridization results of mosquitoes in the Cx. vishnui complex on the DNA chip

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

A～D: 淡色库蚊; E～G: 尖音库蚊; H～J: 致倦库蚊

图7 尖音库蚊复合组蚊虫芯片杂交结果

Fig.7 Hybridization results of mosquitoes in the Cx. pipiens complex on the DNA chip

A

B

C

D

E

F

G

A:福州地区白纹伊蚊; B:长乐地区白纹伊蚊; C:福清地区白纹伊蚊; D:平潭地区白纹伊蚊; E:惠安地区白纹伊蚊; F:涵江地区白纹伊蚊; G: 福州地区伪白纹伊蚊

图8 不同地区白纹伊蚊和伪白纹伊蚊芯片鉴定结果

Fig.8 DNA chip identification results for Ae. albopictus and Ae. pseudoalbopictus from different regions