陈展册 钟勇 郑斯竹 赵晓丽 高文娜 陈舒娴 杜智欣

摘 要 近年来，随着我国进出口贸易量增加，进境货物携带动植物疫病疫情传入风险也随之增加，现场检疫工作急需能够适应口岸快速检验检疫的技术。核酸试纸条检测技术是一种灵敏度高、特异性强、检测时间短、操作简单的可视化检测技术，在食品安全、临床诊断等领域已有相关研究及应用。本文分析了实验室现有检测技术在口岸检疫中的现状，阐述了核酸试纸条检测技术的原理与进展，综述了该技术在口岸检疫中卫生检疫、食品安全检测、动植物检疫、中药材鉴别等领域的研究及应用，并探讨了该技术在口岸检疫工作中的应用前景。

关键词 核酸试纸条；检测技术；口岸检疫；应用前景

Application Prospect of Nucleic Acid Test Strip Detection Technology in Port Quarantine

CHEN Zhan-Ce¹ ZHONG Yong¹ ZHENG Si-Zhu²

ZHAO Xiao-Li³ GAO Wen-Na³ CHEN Shu-Xian¹ DU Zhi-Xin^1*

Abstract In recent years, the escalation of China’s import and export trade has corresponded with an increased risk of the introduction of animal and plant diseases via imported goods. There is an urgent need for on-site quarantine to develop technologies that can rapidly and effectively inspect and quarantine at ports. Nucleic acid test strip detection technology, characterized by high sensitivity, specificity, short detection time, and ease of operation, is a visual detection method that has been explored in domains such as food safety and clinical diagnostics. This paper reviews the current state of laboratory testing techniques in port quarantine, details the technological principles and advancements of nucleic acid test strip detection, and synthesizes research and applications of this technology in various areas including health quarantine, food safety testing, animal and plant quarantine, and the authentication of traditional Chinese medicinal materials within the context of port quarantine. Furthermore, it discusses the potential and prospects of integrating this technology into the ports quarantine.

Keywords nucleic acid test strip; detection technology; ports quarantine; application prospect

基金项目：海关总署科研项目（2021HK173）；国家重点研发计划（2023YFC2604905）；南京海关科研项目（2023KJ10）；市场监督管理总局科技计划项目（2022MK212）

第一作者：陈展册（1984—），女，汉族，广西岑溪人，硕士，高级农艺师，主要从事植物检疫工作，E-mail: chenzhance@163.com

通信作者：杜智欣（1981—），男，汉族，内蒙古赤峰人，博士，高级农艺师，主要从事植物检疫工作，E-mail: xiaoxin0086@126.com

1. 南宁海关技术中心 南宁 530200

2. 苏州海关综合技术中心 苏州 215104

3. 中国海关科学技术研究中心 北京 100000

1. Technology Center of Nanning Customs District, Nanning 530200

2. Suzhou Customs Comprehensive Technology Center, Suzhou 215104

3. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100000

中国口岸科学技术

近年来，动植物疫情和重大传染病方面的传统生物安全威胁和非传统生物安全风险加大。与此同时，在全球经济一体化的背景下，我国进出口贸易量不断增长，对通关效率提出更高要求。

筑牢口岸检疫防线、维护国门生物安全是海关的职责和使命。研发与应用适应口岸快速检验检疫的方法和技术，对口岸检疫工作具有重要意义，不仅能够快速准确地鉴定出威胁人类生命安全、社会安全、环境安全的有害生物及其他病原体，及时有效防控其入侵，还能提高检测效率，缩短检测时限，助力口岸货物快速通关。本文通过分析口岸检疫技术应用现状，探讨核酸试纸条检测技术的研究现状和应用前景。

1 口岸检疫技术应用现状

伴随贸易量的上升，进境产品携带动植物疫病传入风险也随之增加。为防止可能引发人类传染病、动植物疫病疫情的有害生物通过口岸传入我国，海关需在口岸现场及实验室对进境人员、货物按类别开展包括传染病筛查、检疫性有害生物（病毒、病原微生物、昆虫、杂草、线虫等）鉴定、食品安全检测等工作。

目前，传统的实验室检测项目主要有形态学鉴定、残留检测、理化检测、免疫学检测、分子生物学鉴定等。传统检测项目虽然结果准确度较高，但检测时间长，对作业环境、作业人员专业度要求高等。例如，形态学鉴定要对病原微生物进行分离培养，应在特定的检测环境下进行，同时对检测人员技术水平有较高的要求，而且病原微生物的培养时间较长，因此，难以满足口岸快速检测的需求。再如，残留检测（GC法、MS法、GC-MS法、LC-MS法等）、免疫学检测（ELISA）、分子生物学鉴定（PCR等）项目受限于实验仪器设备、实验环境等因素，难以在口岸现场大规模使用。并且还可能存在因免疫学检测试剂产生的灵敏度问题，容易导致作业人员对检测结果产生误判^[1]。

因此，在更好地满足口岸检疫工作需求方面，核酸试纸条检测技术以其低成本和易于使用而受到广泛关注，在即时检验领域也显示出较大潜力。

2 核酸试纸条检测技术概述

核酸试纸条技术将分子生物学技术与胶体金免疫层析技术相结合^[2]，是一种快速的免疫学可视化测定方法。与传统的免疫层析试纸条相比，核酸试纸条法具有灵敏度高、稳定性强、低成本等特点。2007年Aveyard等^[3]首次将特异性PCR产物夹在与金纳米颗粒共价连接的报告寡核苷酸之间，并捕获与硝酸纤维素色谱带共价连接的寡核苷酸，使用无抗体的侧流装置检测特异性PCR产物。同年，Carter等^[4]建立了一种核酸试纸条检测技术，可以从复杂的核酸混合物中检测出特定的分子，10 μL的样品体积减小了试剂消耗，在样品加入2 min后即可检测到多于250 amol的扩增产物DNA，该技术具有强特异性及高敏感性。通过将核酸扩增、侧流层析、分子杂交等技术相结合，核酸试纸条技术还具有比传统检测技术简单、便捷及省时的优点^[5-6]。

2.1 核酸试纸条检测技术的原理

2.1.1 核酸试纸条的构造

核酸试纸条法与胶体金免疫层析试纸条相似，由PVC黏性底板、吸水垫、样品垫、胶体金结合垫和层析膜5个部分组成^[7]，如图1所示。

样品垫用于滴加检测样品，由纤维素或玻璃棉制成，可快速吸收待检样品，使其利用毛细管作用向结合垫侧向流动。

结合垫用于吸附浸润胶体金结合物溶液，由玻璃棉或纤维膜制成，可以与待测样品中的靶标结合成免疫复合物。

层析（NC）膜用于检测线（T线）和质控线（C线）的喷涂，拦截带标记的免疫复合物，由硝化纤维制成，可以直接显示检测结果。

吸水垫用于吸收流过层析膜的待检样品，由纤维素制成，以平衡层析膜两边的压差，从而促使更多待检样品在层析膜中侧向流动。

PVC黏性底板是试纸条的载体和支撑底板，一般为聚氯乙烯材质，要求具有一定的机械强度。

图1 核酸试纸条构造图

Fig.1 Structure diagram of nucleic acid test strip

2.1.2 检测技术原理

核酸试纸条技术将聚合酶链式反应和免疫胶体金带相结合，实现了对目标DNA扩增产物的简单快速检测。由于核酸试纸条捕获的靶标的分子结构不同，可分为抗体无关型和抗体依赖性。

抗体无关型核酸试纸条的原理是在目标基因的特异性引物和探针两端修饰好标记物，在T线固定与目标基因部分片段互补配对的捕获探针，在结合垫固定与目标基因另一结合位点相结合的信号探针，如目标基因存在，捕获探针和信号探针相结合，形成“信号探针-目标基因-捕获探针”聚合物，并聚集在T线。C线上固定可与信号探针互补配对的基因片段，当待测核酸的PCR扩增产物经结合垫时，会携带信号探针继续前行至C线并与基因片段相结合，在试纸条C线处显色，证明该实验有效。当待测核酸的PCR扩增产物中不存在目标基因时，捕获探针无法捕捉信号探针，此时仅在C线处显色。当待测核酸的PCR扩增产物中存在目标基因时，试纸条C线、T线均显色。

抗体依赖性核酸试纸条的原理是通过捕捉目标基因的特异性引物两端修饰的相应标记物，如生物素、荧光素等完成检测。将带有两种标记物（如羧基荧光素F和生物素B）的PCR扩增产物滴加到试纸条的样品垫，利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，使抗原抗体发生反应在固相膜上快速进行，生物素端首先与固定在结合垫上的链霉亲和素的胶体金颗粒结合，形成复合物1（Au-SA-B），复合物1进一步随液相到达T线，固定在Ｔ线上的抗荧光素抗体与复合物1的荧光素标记物结合，形成复合物2（Anti-F-Au-SA-B），停留在T线处并显色，多余的链霉亲和素修饰的胶体金颗粒被C线上的生物素捕获并显色，显示为阳性检测结果；当扩增产物不存在时，链霉亲和素修饰的胶体金颗粒无法停留在T线处，致使T线不显色，而被C线上的生物素捕获而显色，结果为阴性^[6,8]。若T线、C线均无色，说明试纸条已失效，如图2所示。

图2 核酸试纸条检测结果判定图

Fig.2 Determination of nucleic acid detection strip test results

2.2 核酸试纸条检测技术的应用领域

核酸试纸条可以通过结合PCR、多重PCR、重组酶聚合酶扩增反应（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）、环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）、链置换反应（Strand Displacement Reaction，SDA）、赖解旋酶DNA等温扩增（Helicate-dependent Isothermal DNA Amplification，HDA）、滚环扩增技术（Rolling Circle Amplification，RCA）、交叉引物恒温扩增（Cross Priming Amplification，CPA）等多种核酸扩增的方法，将探针或引物标记异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）、地高辛（Digoxin，DIG）或生物素等，扩增产物可以用含有相应抗体标记的试纸条进行检测^[9]。目前核酸试纸条已在真菌毒素、细菌、病毒、线虫、真伪鉴别等检测领域有较多的研究与应用，见表1。

3 核酸试纸条检测技术在口岸检疫中的研究应用

3.1 卫生检疫领域

近年来，国际传染病疫情不断发生变化，新发传染病增多，如埃博拉病毒病裂谷热、黄热病、中东呼吸综合征等。又如新型冠状病毒COVID-19在全世界的流行，给社会、卫生和社会保健服务及科学研究带来挑战^[27]。因此，及时准确有效地开展大规模筛查，以识别和隔离阳性病例，在抗击传染病大流行中发挥着重要作用，同时也是防止其暴发扩散的关键。一种简单、快速、廉价和灵敏的即时检测技术对于诊断和预防传染病至关重要。核酸试纸条检测技术具有高灵敏度、高特异性、高效快速、可视化等优点，可及时检测和快速监测病原体，预防疾病传播扩散。

黄涛等^[28]研制了一种基于双重CRISPR-Cas12a的新型冠状病毒核酸胶体金检测试纸条，检测试纸条可在37℃条件下20 min内取得结果，对SARS-CoV-2病毒的检测灵敏度为250 copy/mL，检测16种其他呼吸道病原体均无交叉反应，在37℃条件下存放8 d仍然具有较好检测效果。Zou等^[29]研究了一种准确、快速、易于实施的等温和非酶信号扩增系统[催化发夹组装（Catalytic Hairpin Assembly，CHA）反应]与基于侧流免疫测定（Lateral Flow Immunochromatography Assay，LFIA）的条带检测方法相结合的技术，可以检测口咽拭子样本中的SARS-CoV-2。整个CHA-LFIA检测方法从鼻咽取样到获得检测结果，耗时不超过90 min。该方法提供了一种快速、简单、灵敏的SARS-CoV-2 RT-PCR检测的替代方法，阳性和阴性预测一致性为100%。姜菲菲等^[30]建立的呼吸道真菌感染核酸胶体金试纸条可以检测白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌等真菌，特异性和灵敏度较高，操作简便且快速。张洁等^[31]建立了绵羊肺炎支原体快速检测方法，通过横向流动试纸条实现可视化检测，最低检测限为1.0×10² cfu/mL，灵敏度是常规PCR的100倍，对已感染绵羊肺炎支原体的临床样本检出率为100%。

黄欢等^[32]建立了一种基于病原体核酸分子的血液安全性检定方法，利用长引物PCR扩增4种病原体核酸，可视化区分血液中乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒和梅毒螺旋体，检测时间为10 min，该方法与传统的检测方法相比，速度快、成本低。岳子晗^[33]采用多酶恒温快速扩增结合侧流层析试纸条快速检测甲型肝炎病毒HAV，该方法方便、灵敏、经济，尤其适用于资源有限地区的甲型肝炎病毒检测。龚真莉等^[35]通过核酸探针与免疫层析相结合建立了一种检测口蹄疫病毒的核酸试纸条，其检测范围为3×10^-4～3×10^-3 μg/μL，灵敏性高于琼脂糖凝胶电泳。丁建松等^[36]开发了一种样品处理、核酸恒温扩增、核酸试纸条快速检测等技术相结合的快速检测血液疟原虫的方法，简便快速、特异性强，灵敏度达10³ copies/mL，适用于在口岸现场对疟疾进行快速筛查。

3.2 食品安全领域

3.2.1 细菌检测

张宏伟等^[37]建立了一种基于聚合酶链反应试纸条技术快速检测小肠结肠炎耶尔森菌的方法。该方法的DNA检测灵敏度达到10^-3 μg/mL，样品加菌试验检测灵敏度可达100 cfu/25 g。刘敏^[38]将交叉引物等温扩增技术与核酸试纸条相结合建立了一种蜡样芽孢杆菌的快速检测方法，具有较强特异性，可用于进出境口岸现场蜡样芽孢杆菌的快速筛查。徐苗苗等^[39]将交叉引物恒温扩增技术（Cross Priming Amplification，CPA）与核酸试纸条相结合，建立了一种副溶血性弧菌快速可视化检测方法。对污染牡蛎中副溶血性弧菌的检测灵敏度为5.2 cfu/g，对纯培养物的检测灵敏度达到58 cfu/mL，其灵敏度比传统的PCR技术高l0倍，并且具有较高的稳定性。李磊等^[11]研制了基于核酸适配体的金黄色葡萄球菌快速检测试纸条，对于人工污染的肉样和奶样进行检测，具有良好特异性，检测灵敏度为1×10⁵ cfu/mL。

3.2.2 真菌毒素检测

王亚芳等^[40]利用胶体金和核酸适配体作为金标探针，构建一种新型层析试纸条以实现对玉米中黄曲霉毒素B₁的快速检测，检出限值低至0.5 ng/mL，在0.5～500 ng/mL范围内快速准确检测且对黄曲霉毒素B₁具有高度特异性，为加快一线粮库入库粮食中真菌毒素的快速检测提供技术支持。

3.2.3 转基因成分检测

近几年来，利用核酸试纸条检测转基因成分的研究较多。例如，汪琳等^[25]建立结合LAMP方法检测转基因作物中的CP4-EPSPS基因，64℃恒温反应30 min后即可根据试纸条显色直接观察结果。该方法特异性高，检测限为10个拷贝的EPSPS DNA。Huang等^[41]建立了CPA结合一次性核酸试纸条检测CaMV35S基因的方法，特异性良好，检测限是30拷贝的含CaMV35S启动子序列的质粒pBI121DNA，最低能检测到含量0.05%的MON810标准样品，且重复性良好。利用该试纸条检测豆粉、豆粕、饼干、饲料等9组样品中的CaMV35S，与实时PCR技术对比发现检测结果一致。张裕君等^[42]建立了一种快速、灵敏检测转基因黑曲霉的PCR核酸试纸条法，10 min后即可观察结果，与传统凝胶电泳法相比，检测速度大大提升。

3.2.4 源性成分检测

赵良娟等^[43]等建立肉及肉制品中鸭源成分快速检测的可视化核酸试纸条法，检测灵敏度为0.1%，能够从鸭肉样品中扩增出291 bp特异性DNA片段，而其他动植物样品无扩增条带。该核酸试纸条法特异性好、灵敏度高、简便、快速。姜海瀛等^[44]建立肉类食品中牛肉PCR-核酸试纸条快速鉴定方法，并开发快速检测试剂盒，克隆测序后的牛肉DNA序列与牛线粒体DNA特异指纹区段序列同源性100%。模板DNA最低检出量为1 pg/μL。该研究建立的PCR-核酸试纸条方法特异性强、灵敏、准确、简便、快速，研制的试剂盒操作简便快速、结果可视且稳定，适用于实地监测。王之莹^[45]开发了一种基于RPA技术的侧流层析核酸试纸条，可在牦牛奶和牛奶的混合物中检测到低至5%的牦牛奶，整个扩增和检测过程在40 min内完成。田卓等^[46]建立PCR-核酸试纸条法快速检测鸽子源性成分，核酸试纸条特异性高，绝对灵敏度为0.0013 ng/μL；对于混合样品，实际灵敏度为0.01%；对于加工处理样品，实际灵敏度为0.1%；最低检测限检出率为100%，稳定性良好。

3.3 动物检疫领域

房敬真等^[47]根据迟缓爱德华氏菌溶血相关基因eha设计保守引物，建立迟缓爱德华氏菌快速、可视化核酸试纸条检测技术。该技术快速、灵敏，具有良好的特异性，灵敏度可达到30 cfu/mL，比琼脂糖凝胶成像检测技术灵敏度要高近10倍。龚真莉等^[35]通过核酸探针与免疫层析相结合的方法，建立了一种简单、敏感、特异的检测口蹄疫病毒的方法，检测范围为3×10^-4～3×10^-3 μg/μL，敏感性高于琼脂糖凝胶电泳。王之莹等^[18]将PCR与胶体金试纸条技术结合开发了一种低成本的侧流核酸测定试纸条，仅需要一台普通PCR仪即可对非洲猪瘟病毒进行快速灵敏的鉴定，耗时不到2 h，该方法成本低、操作简便，对条件有限的口岸非常适用。陈诗胜等^[48]开发了检测导致奶牛乳房炎的无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和停乳链球菌的PCR核酸免疫层析试纸条快速检测方法，均具有较好的特异性，且灵敏度比凝胶电泳高，最低检测限比凝胶电泳法低10倍。

3.4 植物检疫领域

近年来，我国各进境口岸陆续从进口的花卉、水果、种苗等植物及其产品上检出松材线虫、南芥菜花叶病毒等检疫性有害生物。口岸检疫是防止境外有害生物远距离传播的最有效方式，核酸试纸条检测技术可以成为口岸实施有效检疫的有力手段。

俞禄珍等^[49]建立了环介导等温扩增和核酸试纸条检测技术用于鉴定检疫性有害生物——剪股颖粒线虫，LAMP-核酸试纸条检测法的特异性强、灵敏度高，最低检测限为3.15 ng，检测灵敏度达1/400条2龄幼虫。该法操作简单，对设备要求低，适合在口岸推广应用。张裕君等^[22]通过将聚合酶链式反应与核酸试纸条检测方法相结合，建立了一种可视化核酸试纸条法用以快速检测松材线虫，检测时间从2 h缩短为10 min，大大提高了检测效率，核酸试纸条法的检测灵敏度比传统电泳凝胶成像高50倍以上，在口岸检疫实验室对松材线虫进行快速鉴定方面具有良好的应用前景。霍亚云等^[50]建立黄瓜绿斑驳花叶病毒核酸试纸条检测技术，能够有效区分黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）及同样侵染葫芦科作物的黄瓜花叶病毒（CMV）、辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）、烟草花叶病毒（TMV）、番茄花叶病毒（ToMV）和小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV），该方法可检测低至24.300 ng/μL的总RNA，具有较高的灵敏度，且操作简便，适用于基层口岸的检疫工作。曹成等^[51]建立南芥菜花叶病毒RT-PCR扩增产物胶体金层析和酶联检测方法，15 min即可获得检测结果。

3.5 中药材检测领域

在进境中药材时，部分不法进口商用关税较低的货物品名申报，以逃避关税。因此，口岸需要加强进境中药材的真伪鉴定工作。核酸试纸条检测技术目前已在中药材鉴定领域有研究报道，为进出境口岸中药材的真伪鉴别、快速通关提供了新的方法和思路。

李亚茹等^[52]通过PCR-核酸试纸条对蛤蟆油药材进行真伪快速鉴定，其检测结果可视化且具有特异性。该技术适用于口岸进境中药材真伪鉴定。迟凯月等^[12]建立PCR-核酸试纸条检测方法对蛤蚧真伪进行定性鉴别，正品蛤蚧在PCR-核酸试纸条上均出现2条带，伪品以及阴性对照均出现1条带，短时间内可实现蛤蚧可视化检测，且操作方便、结果准确。孟媛等^[53]构建一种能够可视化PCR产物检测试纸条，快速鉴定中药全蝎及其伪混品，灵敏度达到1.0×10^-2 ng/μL。该方法特异、灵敏、稳定、简单、快速，为中药全蝎的真伪鉴定提供了安全可行的方法。徐宁等^[54]将DNA分子遗传标记技术的高灵敏性与免疫核酸试纸条的可视化相结合，实现了鹿茸真伪在分子水平上快速、特异性、可视化鉴定。该方法可以在分子水平上鉴定出正品梅花鹿茸、马鹿茸。

4 前景与展望

核酸试纸条检测技术因其成本低廉和易于操作的优点，在人类疾病、食品安全和动植物检疫等领域有着巨大的发展潜力和应用前景。目前核酸试纸条已成功应用于临床诊断、食品安全监测、兽医、农业等诸多领域。

在口岸检疫中，核酸试纸条检测技术在传染病、动物检疫等领域研究应用较多（如新冠病毒、诺如病毒、非洲猪瘟等），但在植物检疫领域还少有研究报道，仅松材线虫、剪股颖粒线虫有相关报道。核酸试纸条检测技术在植物检疫领域可以进行更深入的研发，如检疫性有害生物（昆虫、线虫、真菌、细菌、病毒、软体动物等）、外来入侵物种的鉴定等。

在口岸检疫中应用核酸试纸条法检测技术有以下优点：一是高效快速，无须凝胶电泳紫外分析和ELASA方法的多步骤孵育和洗涤，核酸试纸条能够在5 min内对核酸扩增产物完成快速检测；二是灵敏度高，可用于口岸检疫中截获的不同状态的有害生物，包括龄期较小的若虫、残缺不全的残体等，无法进行形态鉴定的有害生物亦可以通过PCR核酸试纸条法准确判定；三是成本低，不依赖精密且价格高昂的仪器设备，适合基层口岸一线或偏远地区推广使用；四是特异性强，能够很好地将目标有害生物区分开来；五是操作简便，结果直观，只需肉眼即可判定，基层口岸可操作性强。

在口岸检疫过程中使用该技术，实现口岸现场对截获有害生物（卵、低龄若虫等未成熟虫态，残体）的快速鉴定，提高鉴定工作的准确性和时效性，在达到快速通关的基础上，还可以第一时间在口岸一线发现疫病疫情，完善口岸疫病疫情的监测布控。综上所述，核酸试纸条检测技术在口岸检疫中具有广阔的应用前景。

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表1 核酸试纸条检测技术的应用领域

Table 1 Application fields of nucleic acid test strip detection technology