周洁 黄夏宁 林洁 覃杨光 郭枫

摘 要 CRISPR-Cas技术是一种基于基因编辑原理的核酸检测技术，具有高特异性、高灵敏度、快速便捷、适用性广泛等优点，在核酸检测领域拥有广阔的应用前景。近年来，该技术在核酸检测中的应用取得了快速发展，已用于检测病毒、细菌、真菌、基因突变等多种核酸靶标，并展现出优于传统方法的性能。本文综述了CRISPR-Cas技术在核酸检测中的应用进展，涵盖了靶向DNA、RNA和DNA/RNA的检测方法，并对其优势和局限性进行了总结。在应用方面，CRISPR-Cas技术具有快速、便捷、灵敏的特点，能够满足口岸检验检疫快速筛查、现场检测等需求，有望成为口岸生物安全防控的新利器。

关键词 CRISPR-Cas技术；核酸检测；特异性；灵敏度；口岸检验检疫

Research Progress of CRISPR-Cas Technology in Pathogenic Microorganism Detection

ZHOU Jie ¹ HUANG Xia-Ning ¹ LIN Jie ¹ QIN Yang-Guang ¹ GUO Feng ^1*

Abstract CRISPR-Cas technology, a powerful nucleic acid detection technology based on the principles of gene editing, has gained broad application prospect in the field of nucleic acid detedction due to its distinctive advantages of high specificity, high sensitivity, fast and convenient, and wide applicability. In recent years, the application of this technology in nucleic acid detection has made rapid development, and has been used to detect viruses, bacteria, fungi, gene mutations and other nucleic acid targets, and has shown better performance than traditional methods. This article overviews the application of CRISPR-Cas technology in nucleic acid detection, encompassing detection methods for targeting DNA, RNA, and DNA/RNA. Furthermore, a detailed discussion on the advantages and limitations of CRISPR-Cas technology is presented. Notably, in terms of application, the rapid, convenient, and sensitive features of CRISPR-Cas technology render it a promising tool for rapid screening and on-site detection in port inspection and quarantine, potentially serving as a new weapon in the fight against biological threats at ports.

Keywords CRISPR-Cas technology; nucleic acid detection; specificity; sensitivity; port inspection and quarantine

基金项目：国家重点研发计划项目（2023YFC260490）；海关总署科研项目（2019HK136）；南宁海关科研项目（2023NNHG07）；广西纳米抗体研究重点实验室开放课题（2022NMKT002）

第一作者：周洁（1994—），女，汉族，广西河池人，博士，主要从事口岸卫生检疫工作，E-mail: zhoujie283@outlook.com

通信作者：郭枫（1980—），男，汉族，山东曹县人，本科，主治医师，主要从事口岸卫生检疫工作，E-mail: 54715970@qq.com

1. 广西国际旅行卫生保健中心（南宁海关口岸门诊部） 南宁 530028

1. Guangxi International Travel Healthcare Centre (Port Clinic of Nanning Customs District), Nanning 530028

中国口岸科学技术

病原微生物引发的安全问题严重威胁人类健康和经济发展。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）数据显示，感染性疾病已成为全球人类死亡的主因之一，其中中低收入国家更受影响^[1]。2022年，我国相关的统计数据显示，全年甲类、乙类传染病（除新型冠状病毒感染外）的报告发病数仍未低于240万例^[2]。因此，病原微生物的快速检测和识别意义重大。理想的病原体检测方法应具备快速、高灵敏度、特异性、经济实惠、易于操作等特点，以满足临床诊断、疫情防控和日常监测等需求。近年来，基于CRISPR-Cas系统的核酸检测技术因其快速、即时、灵敏、特异等优势，引起了广泛关注，有望成为核酸检测领域的理想技术。

CRISPR-Cas系统具有基因编辑的卓越生物学特性，其应用于核酸检测领域实现了对病原微生物的快速识别和定量分析。Cas12、Cas13等Cas核酸酶通过切割靶标核酸后可激活非特异性附属切割活性，能够切割周围的RNA或DNA分子来扩大和可视化检测信号，实现对目标核酸的高灵敏度和高特异性的诊断^[3]。本文总结了CRISPR-Cas技术的类型和特点，重点介绍其在病原微生物核酸检测中的概况，通过与传统核酸检测方法比较，展望了在口岸检验检疫、筑牢生物安全防线中的作用和应用前景。

1 CRISPR-Cas技术类型

CRISPR-Cas系统于1987年在大肠杆菌中被发现^[4]，因其结构为一组由不相关、不重复但类似的短序列隔开的重复序列组成，故最初被命名为CRISPR^[5]。后续研究发现CRISPR序列与入侵DNA同源，证实其介导了一种适应性免疫防御机制^[6]。该系统是起源于古细菌和细菌的RNA引导的适应性免疫系统，通过获得、表达和干扰3个阶段抵御外来侵袭^[7]。获得阶段：Cas1-Cas2复合体识别并整合外来DNA片段入CRISPR序列，形成免疫记忆；表达阶段：外来DNA再次入侵时，CRISPR序列转录成crRNA，与Cas蛋白结合形成复合体；干扰阶段：由Cas蛋白识别并进一步切割含有靶序列上的原型间隔序列毗邻基序（PAM）序列的入侵核酸，完成免疫防御，而PAM序列是crRNA引导Cas蛋白识别靶序列的关键^[8]。CRISPR-Cas系统根据Cas蛋白的功能和组成，可分为两大类（类别1、类别2）、六型（Ⅰ—Ⅵ型）和48个亚型^[9]，不同类型的Cas蛋白具有不同的特性及应用领域（表1）。类别1包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型，由多个Cas蛋白组成复合体，负责从病毒中获取核酸，并储存在细胞核酸序列成为免疫记忆。类别2包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型，仅需1个大的多功能结合域的Cas核酸酶，利用向导RNA（gRNA）或crRNA来引导Cas蛋白切割再次入侵的病毒核酸，实现抗病毒的效果。Cas9存在于所有Ⅱ型系统中；而Ⅴ型和Ⅵ型系统则包含多种变体，如Cas12a、Cas12b、Cas14、Cas13a和Cas13b。其中，Ⅴ型系统主要负责切割DNA，而Ⅵ型系统则只能切割RNA^[10]。

2 CRISPR-Cas技术在核酸检测中的应用

CRISPR-Cas技术具有高度的灵活性和可编程性，已经成为基因编辑和核酸检测的强有力工具。在基因编辑方面，CRISPR-Cas9系统是最常用的一种，它可以通过sgRNA将Cas9蛋白精准定位到PAM靶位点，并对双链DNA进行切割。而CRISPR-Cas12、Cas13和Cas14系统常常是利用“附带切割”能力进行核酸检测，即在crRNA与靶序列结合后激活Cas蛋白，并对非靶向的核酸片段进行切割，从而放大检测信号^[11]。

2.1 靶向DNA的CRISPR-Cas技术

在基于靶向DNA的CRISPR-Cas技术中，Cas12a和Cas14是两种重要的Cas蛋白，它们具有不同的特点和应用。Cas12a又称Cpf1，是CRISPR-Cas系统中的一类蛋白，属于Ⅴ型。在crRNA的引导下，Cas12a能够识别富含T碱基PAM结构的DNA，并将其切割成双链或单链。其还拥有“附带切割”的能力，即除了切割靶标DNA外，还可以切割非靶的DNA^[12]。利用Cas12a切割能力，有研究开发了DETECTR和HOLMES等核酸检测平台检测HPV、乙脑病毒等病原体，无须将DNA产物转录为RNA，检测时间缩短至1 h^{[9, 13]}。高通量平台CaT-SMelor利用Cas12a还可检测尿酸、对羟基苯甲酸等小分子物质^[14]。此外，Cas12相关技术目前在海关系统中已被用于多种传染病的检测技术研发，例如，基于CRISPR/Cas12a和RT-RAA的方法，可以在50 min内快速、灵敏和特异地检测非洲马瘟病毒（African Horse Sickness Virus，AHSV）S7基因^[15]；利用RPA-CRISPR-Cas12a技术的方法，可以在30 min内简单、低廉和准确地检测非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV），并通过荧光探针或便携式荧光仪观察信号变化，判断检测结果^[16]。

Cas14是一种新型的CRISPR-Cas系统，它以一种独立于PAM序列的方式，特异性地瞄准ssDNA底物，具备极高的特异性靶向活性^[17]，利用Cas14开发的Cas14-DETECTR平台检测SNP，具有更强烈的特异性和活性，实现高保真度的SNP检测，而不受PAM序列存在的限制，为SNP检测提供了高度精确和强大的基因分型工具^[18]。

2.2 靶向RNA的CRISPR-Cas技术

Cas13a是目前发现的唯一一个可以靶向ssRNA的核酸酶，并且Cas13a的附属切割活性也只针对ssRNA^[19]。对DNA样本进行检测时，需要先使用T7聚合酶将DNA转录为ssRNA才能进行后续的检测，因此称Cas13a为靶向RNA的CRISPR-Cas技术。CRISPR-Cas13a的出现是CRISPR-Cas技术的重大突破，为核酸检测提供了新手段。有研究开发了SHERLOCK、SHERLOCKv2和HUDSON等多种基于Cas13a的检测平台，通过对样本DNA进行扩增、T7聚合酶转录、Cas13a切割和荧光或金标检测等实现对特定靶标序列的富集、测序和可视化，揭示抗微生物药物耐药性基因、寨卡病毒和登革热病毒及其突变等目标DNA或RNA序列具体信息。SHERLOCK可以在纸基传感器上实现结果可视化解读，用于检测非洲和美国寨卡病毒的变异体^[20]。SHERLOCKv2是SHERLOCK的改进版本，采用了4种不同的Cas蛋白，实现了多通道多重分析，提高了系统的灵敏度；还通过采用金标层析法，简化结果解读方式，用于检测患者体液活检样本中的寨卡病毒和登革热ssRNA病毒及其突变^[21]。HUDSON技术采用加热和化学还原两种手段高效消除核酸酶和病毒颗粒，使SHERLOCK核酸检测系统可直接从患者体液样本中提取核酸并分析所需信号^[22]。

2.3 靶向DNA/RNA的CRISPR-Cas技术

Cas9蛋白属于CRISPR-Cas系统中类别 2中的Ⅱ型蛋白，在sgRNA的引导下，能够特异识别并切割靶向DNA^[23]。此外，sgRNA/Cas9 复合体也能识别并切割含有PAM位点的ssDNA或ssRNA^[24]，同时对DNA和RNA进行检测。科学家们开发了多种基于CRISPR-Cas技术的检测平台，它们可以分为两大类：一类是依赖于Cas蛋白的切割功能，另一类是利用Cas蛋白的识别能力。前者包括FLASH^[25]、NASBACC^[26]和CAS-EXPAR^[27]等，它们通过对样本DNA进行磷酸酶处理、Cas9切割、核酸扩增和荧光染色等步骤，实现了对特定靶标序列的富集、测序和可视化，能够揭示目标DNA序列的具体信息，如抗微生物药物耐药性基因和寨卡病毒的变异体；后者包括荧光素酶重组法^[28]、DNA-FISH法^[29]和CRISPR-Chip法^[30]等，它们通过将荧光素酶或荧光标记连接到失活的Cas9（dCas9）上，或将dCas9固定在石墨烯场效应晶体管（gFET）上，使其在sgRNA的引导下，识别并结合到靶DNA或RNA，从而产生荧光信号或电化学信号，实现无切割检测方法，省略了扩增技术需求，简化了操作流程，提高了检测效率。CRISPR-Cas9不依赖酶切功能的检测技术，为DNA和RNA检测提供了一种新的解决方案。

3 CRISPR-Cas技术对核酸检测的优势

传统核酸检测方法，如PCR和基因测序，虽然在过去的几十年中取得了显著进展，但仍然面临一些局限性，如复杂的样品处理、较长的反应时间和可能的交叉反应。在这一背景下，CRISPR-Cas技术的出现为核酸检测领域带来了新的机遇。在此，笔者总结了CRISPR-Cas技术在核酸检测中的优势，以便更全面地了解其在现代生物医学和疫情防控中的潜在应用。

3.1 高度特异性

CRISPR-Cas技术是一种利用Cas蛋白的高度特异性识别和切割靶向DNA或RNA的方法，它依赖于引导RNA或引物的设计，确保与目标核酸序列高度匹配，而与非目标序列不匹配。这种设计保证只有目标核酸与Cas蛋白结合并激活切割反应。因此，该技术能够有效区分多种病原体或基因突变，并对其进行精确地检测，展示了CRISPR-Cas技术的强大潜力和广阔前景。

3.2 高灵敏度

高灵敏度对于早期疾病诊断至关重要。CRISPR-Cas技术通过引入放大机制来提高灵敏度。例如，CRISPR-Cas12系统具有“切割放大”的能力，一旦Cas12与目标核酸结合，它将迅速切割周围的非目标核酸，释放出荧光或发光信号，从而被便携式荧光探测器所检测，其灵敏度可以达到微摩尔级别^[31]。这种放大效应使得CRISPR-Cas技术能够检测到微量的目标核酸，从而大大降低了病原检测的假阴性概率。

3.3 高速度和效率

CRISPR-Cas技术在核酸检测领域展现出卓越的速度和效率优势。以CRISPR-Cas12为例，其完成整个检测过程（包括样品处理、反应和结果读取）所需时间不超过30 min^[32]。该技术的快速检测能力对于流行病学调查和临床诊断至关重要，能够及时采取必要的干预措施。此外，CRISPR-Cas核酸检测还具备高效性的特点，可以同时检测多个样本，且每个样本的检测时间相对较短，这对于大范围疫情监测和控制具有重要意义，能够帮助及时识别病毒传播趋势并制定相应的公共卫生策略。

3.4 适用性广泛

CRISPR-Cas技术不仅能够检测不同类型的核酸，还可以应用于多种实际场景。例如，其已被成功用于检测病毒、细菌、真菌、基因突变等多种核酸目标。这种广泛的适用性使得CRISPR-Cas技术成为一个多功能的检测工具，可用于医疗、环境监测和食品安全等领域。在医疗领域，它可以用于检测遗传病、癌症、感染性疾病等多种疾病的分子标志物，并为临床决策提供依据；在环境监测领域，它可以用于检测水源、土壤和空气中的有害微生物或污染物，并为环境保护和治理提供数据支持；在食品安全领域，它可以用于检测食品中的致病菌或转基因成分，并为食品质量和安全提供保障等。

3.5 低成本

CRISPR-Cas技术通常相对经济高效，所需的试剂成本较低，无须昂贵的设备。例如，Chen等展示了一种低成本的CRISPR-Cas12检测方法，仅需简单的反应组件和手持式荧光探测器即可实现敏感的核酸检测^[31]。这一优势使得CRISPR-Cas技术在资源有限的环境中具有广泛应用潜力，可以作为廉价而有效的诊断工具，帮助人们及时发现和治疗各种传染性或遗传性疾病，或在紧急情况下用作便携式检测工具，提高防控效率。

4 CRISPR-Cas技术对核酸检测的局限性

CRISPR-Cas技术作为一种新型的核酸检测工具，除了上述优点之外，也面临着挑战和局限性，如存在脱靶效应、技术复杂程度高和样本处理烦琐等问题。本文将针对这些挑战和局限性进行探讨，并提出相应的解决方案，以期推动CRISPR-Cas技术在核酸检测领域的应用。

4.1 降低脱靶效应

特异性是CRISPR-Cas技术应用的关键。为了确保高度特异性，降低脱靶效应，需要在gRNA或引物的设计上精雕细琢，主要包括以下几个方面：充分考虑目标核酸序列的特征，选择合适的靶点区域；优化引导RNA或引物的长度和碱基组成，提高与目标序列的匹配度；采用二级结构预测等方法，避免引导RNA或引物与非目标序列的结合。此外，还需要考虑目标环境和条件对特异性的影响。例如，在复杂的环境中可能存在与目标序列高度相似的非目标序列，这会增加假阳性结果的风险^[33]。因此，需要根据实际应用场景，对引导RNA或引物进行相应的调整。除了在引物上下功夫外，新一代CRISPR-Cas系统的开发也为提高特异性提供了新的思路，如Cas9和Cas12a等新型Cas蛋白，则具有更高的特异性，可以有效降低脱靶效应。

4.2 简化技术操作

CRISPR-Cas技术的复杂性是限制其广泛应用的主要因素之一。为了简化技术操作，需要在以下几个方面进行努力：开发更加便捷的引导RNA或引物设计工具，降低设计难度和时间成本；构建标准化的实验流程，减少人为操作带来的误差；探索多联检等技术方案，提高检测效率；开发更易于使用的仪器设备，例如便携式检测仪，以便在现场或基层进行快速检测。此外，尽管许多基于CRISPR-Cas的检测方法已经结合了等温扩增技术，但大多数仍然需要核酸扩增技术，此步骤可能带来一些技术限制，包括延长检测时间、增加检测成本、降低检测灵敏度等^[34]。因此，在具体应用中，相关技术的标准化和自动化仍需根据实际需求进一步发展。

4.3 优化样本处理

样本处理是核酸检测的关键环节之一，也是影响检测结果准确性的重要因素。样本中可能存在多种类型的干扰因子和杂质，如血液中的血红蛋白或唾液中的酶，这些可能会降低核酸的纯度和浓度，从而影响检测结果。为了提高样本处理效率，需要开发高效的核酸提取和净化方法，如可以利用纳米材料或微流体技术，实现快速、高通量的核酸提取和净化^[35]。同时还需要根据不同样本类型和检测需求选择和优化适当的前处理方法，如对于临床样本，需要进行更严格的核酸提取和纯化，以确保检测结果的准确性^[31]。

5 展望

CRISPR-Cas技术在核酸检测领域具有广阔的应用前景，有望在公共卫生、微生物检验、食品安全、环境监测等领域发挥重要作用。在口岸检验检疫领域，CRISPR-Cas技术可用于快速、精准地识别多种病原体，提升口岸生物安全水平。与传统检测方法相比，CRISPR-Cas技术具有高特异性、高灵敏度、快速便捷等优势。随着CRISPR-Cas技术的不断发展和完善，其在口岸检验检疫领域的应用将会更加广泛。尤其是在病原多重检测、缩短检测时间以及现场检测等方面，CRISPR-Cas技术具有明显优势，能够更好地满足口岸检验检疫领域的实际需求。笔者相信随着技术的不断进步，CRISPR-Cas技术有望在病原微生物检测领域取得更大的突破，成为口岸检验检疫工作中的重要工具，为疾病防控和生物安全提供更加有效的解决方案。

参考文献

[1] World Health Organization (WHO). World Health Statistics 2023: Monitoring Health for the Sdgs, Sustainable Development Goals[EB/OL]. https://www.who.int/publications/i/item/9789240074323.

[2] 国家卫健委. 2022年我国卫生健康事业发展统计公报[EB/OL]. http://www.nhc.gov.cn/cms-search/downFiles/8a3994e41d944f589d914c589a702592.pdf.

[3] Kostyusheva A, Brezgin S, Babin Y, et al. Crispr-Cas Systems for Diagnosing Infectious Diseases[J]. Methods, 2022: 431-446.

[4] Nakata A, Amemura M, Makino K. Unusual Nucleotide Arrangement with Repeated Sequences in the Escherichia Coli K-12 Chromosome[J]. Journal of Bacteriology, 1989, 6: 3553-3556.

[5] Jansen R, Embden JD, Gaastra W, et al. Identification of Genes that are Associated with Dna Repeats in Prokaryotes[J]. Molecular Microbiology, 2002, 6: 1565-1575.

[6] Horvath P, Barrangou R. Crispr/Cas, the Immune System of Bacteria and Archaea[J]. Science, 2010, 5962: 167-170.

[7] Makarova KS, Haft DH, Barrangou R, et al. Evolution and Classification of the Crispr-Cas Systems[J]. Nature Reviews Microbiology, 2011, 6: 467-477.

[8] Leenay RT, Beisel CL. Deciphering, Communicating, and Engineering the Crispr Pam[J]. Journal of Molecular Biology, 2017, 2: 177-191.

[9] Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS, et al. An Updated Evolutionary Classification of Crispr-Cas Systems[J]. Nature Reviews Microbiology, 2015, 11: 722-736.

[10] Makarova KS, Zhang F, Koonin EV. Snapshot: Class 2 Crispr-Cas Systems[J]. Cell, 2017, 328: 1-2.

[11] 陈逸凡, 尹利民. Crispr/Cas技术在病原体检测中的应用[J]. 检验医学与临床, 2022, 7: 981-985.

[12] Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, et al. Clustered Regularly Interspaced Short Palindrome Repeats (Crisprs) Have Spacers of Extrachromosomal Origin[J]. Microbiology-Sgm, 2005, 151(8): 2551-2561.

[13] Hille F, Richter H, Wong SP, et al. The Biology of Crispr-Cas: Backward and Forward[J]. Cell, 2018, 6: 1239-1259.

[14] Liang M, Li Z, Wang W, et al. A Crispr-Cas12a-Derived Biosensing Platform for the Highly Sensitive Detection of Diverse Small Molecules[J]. Nature Communications, 2019, 1: 3672.

[15] 黄超华, 周华亮, 吴江, 等. 基于Crispr/Cas12a技术的非洲马瘟病毒可视化检测方法的建立[J]. 中国兽医科学, 2023, 53(6): 679-683.

[16] 徐博文, 周傲白雪, 林志达, 等. 非洲猪瘟病毒的Rpa-Crispr-Cas12a快速检测方法的建立[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2023, 14: 86-90.

[17] Aquino-Jarquin G. Crispr-Cas14 is Now Part of the Artillery for Gene Editing and Molecular Diagnostic[J]. Nanomedicine, 2019: 428-431.

[18] He Y, Shao S, Chen J. High-Fidelity Identification of Single Nucleotide Polymorphism by Type V Crispr Systems[J]. Acs Sensors, 2023: 8-12, 4478-4483.

[19] Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, et al. C2C2 is a Single-Component Programmable Rna-Guided Rna-Targeting Crispr Effector[J]. Science, 2016, 6299: aaf5573.

[20] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, et al. Multiplexed and Portable Nucleic Acid Detection Platform with Cas13, Cas12a, and Csm6[J]. Science, 2018, 6387: 439-444.

[21] Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Kellner MJ, et al. Nucleic Acid Detection of Plant Genes Using Crispr-Cas13[J]. Crispr Journal, 2019, 3: 165-171.

[22] Myhrvold C, Freije CA, Gootenberg JS, et al. Field-Deployable Viral Diagnostics Using Crispr-Cas13[J]. Science, 2018, 6387: 444-448.

[23] Makarova KS, Wolf YI, Iranzo J, et al. Evolutionary Classification of Crispr-Cas Systems: A Burst of Class 2 and Derived Variants[J]. Nature Reviews Microbiology, 2020, 2: 67-83.

[24] Wu Y, Battalapalli D, Hakeem MJ, et al. Engineered Crispr-Cas Systems for the Detection and Control of Antibiotic-Resistant Infections[J]. Journal of Nanobiotechnology, 2021, 1: 401.

[25] Quan J, Langelier C, Kuchta A, et al. Flash: A Next-Generation Crispr Diagnostic for Multiplexed Detection of Antimicrobial Resistance Sequences[J]. Nucleic Acids Research, 2019, 14: e83.

[26] Pardee K, Green AA, Takahashi MK, et al. Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components[J]. Cell, 2016, 5: 1255-1266.

[27] Huang M, Zhou X, Wang H, et al. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 Triggered Isothermal Amplification for Site-Specific Nucleic Acid Detection[J]. Analytical Chemistry, 2018, 3: 2193-2200.

[28] Zhang Y, Qian L, Wei W, et al. Paired Design of Dcas9 as a Systematic Platform for the Detection of Featured Nucleic Acid Sequences in Pathogenic Strains[J]. Acs Synthetic Biology, 2017, 2: 211-216.

[29] Guk K, Keem JO, Hwang SG, et al. A Facile, Rapid and Sensitive Detection of Mrsa Using a Crispr-Mediated Dna Fish Method, Antibody-Like Dcas9/Sgrna Complex[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2017: 67-71.

[30] Hajian R, Balderston S, Tran T, et al. Detection of Unamplified Target Genes Via Crispr-Cas9 Immobilized On a Graphene Field-Effect Transistor[J]. Nature Biomedical Engineering, 2019, 6: 427-437.

[31] Chen JS, Ma E, Harrington LB, et al. Crispr-Cas12a Target Binding Unleashes Indiscriminate Single-Stranded Dnase Activity[J]. Science, 2018, 6387: 436-439.

[32] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic Acid Detection with Crispr-Cas13a/C2C2[J]. Science, 2017, 6336: 438-442.

[33] Power JF, Carere CR, Lee CK, et al. Microbial Biogeography of 925 Geothermal Springs in New Zealand[J]. Nature Communications, 2018, 1: 2876.

[34] Bhatt A, Bumbrah GS, Ruwali M, et al. Diagnostic Efficiency of Rt-Lamp Integrated Crispr-Cas Technique for Covid-19: A Systematic Review and Meta-Analysis[J]. Pathogens and Global Health, 2022, 7: 410-420.

[35] Broughton JP, Deng X, Yu G, et al. Crispr-Cas12-Based Detection of SARS-Cov-2[J]. Nature Biotechnology, 2020, 7: 870-874.

表1 常见用于核酸检测的Cas蛋白酶特性

Table 1 Characteristics of common cas proteins for nucleic acid detection