谭春翠 杜缘园 陈智刚 欧玉玲 徐艺溶 莫程程 黄慧 蔡翔宇

摘 要 黄酮是植物中重要的一类次级代谢产物，在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，也有以游离形式存在的。黄酮类化合物具备抗氧化、抗菌以及抗病毒等多种生物活性，被大量应用于药品、食品、化妆品、畜禽饲料添加剂等行业，不同于人工合成添加剂混有有害杂质或用量过大时容易造成对机体的危害，其作为天然添加剂，不仅提高了食品的质量和安全性，还降低了环境污染。本文阐述了植物中总黄酮提取和测定方法，并进行了分类统计，分析各种方法的优缺点，对总黄酮测定存在的问题和今后的研究方向提出建议，为开展相关研究的科研工作者提供参考。

关键词 植物；总黄酮；提取；测定方法

Research Progress on Detection Methods of Total Flavonoids in Plants

TAN Chun-Cui¹ DU Yuan-Yuan² CHEN Zhi-Gang¹ OU Yu-Ling¹

XU Yi-Rong¹ MO Cheng-Cheng¹ HUANG Hui¹ CAI Xiang-Yu^1*

Abstract Flavonoids are an important class of secondary metabolites in plants, which mostly exist in the form of glycosides or carbohydrates synthesized by glycosylation, as well as in free form. Flavonoids have various biological activities such as antioxidant, antibacterial, and antiviral properties, and are widely used in industries such as pharmaceuticals, food, cosmetics, and animal feed additives. As natural additives, flavonoids are different from artificially synthesized additives that contain harmful impurities or easily cause harm to the body when used in excessive amounts. They can not only improve the quality and safety of food, but also reduce environmental pollution. This article elaborates on the extraction and determination methods of total flavonoids from plants, conducts classification statistics, analyzes the advantages and disadvantages of various methods, and proposes suggestions for the problems and future research directions of total flavonoid determination, providing reference for future researchers in related research.

Keywords plants; total flavonoids; extraction; determination method

基金项目：南宁海关科研项目（2023NNHG06）；广西壮族自治区市场监督管理局科技计划项目（GXSJKJ2024-21）

第一作者：谭春翠（1994—），女，壮族，广西田东人，本科，助理工程师，主要从事食品安全与检测工作，E-mail: 751389849@qq.com

通信作者：蔡翔宇（1989—），男，汉族，广西凭祥人，本科，高级工程师，主要从事食品安全与检测工作，E-mail: 116152205@qq.com

1. 南宁海关技术中心 南宁 530021

2. 广东海洋大学 湛江 524088

1. Nanning Customs Technology Center, Nanning 530021

2. Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088

黄酮类化合物是指两个苯环通过中央三碳相互连接而成的一系列化合物。黄酮类化合物的颜色与分子中存在的交叉共轭体系及助色团（-OH、-CH₃）等的类型、数目及取代位置有关，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮^[1]。

黄酮是日常饮食的重要微量营养素，也是中药及复方中存在的一类重要有效成分^[2]。黄酮类化合物具有抗氧化性^[3]、抗突变、抗衰老、抗肿瘤^[4]、抗菌消炎^[5-7]等生物活性，黄酮类化合物不能在人体内直接合成，必须通过食物获得，是人类饮食中最丰富的多酚类物质，约占摄入总量的2/3^[8]。黄酮不仅对人体有益处，在畜禽饲料中添加黄酮类化合物，不仅可以优化动物的生长性能，还可以提升其生产性能和繁殖性能^[9]。仙草、茶叶、葛根、枸杞、竹叶^[10-14]等这些植物都含有黄酮，在医药、食品、畜禽饲料添加剂等行业^[15-16]有较广阔的应用前景，故而深入研究优化黄酮的提取分离对食品及医药工业的发展具有重要意义。但由于提取技术不成熟以及生产过程中不能最大限度保留黄酮的生物活性等问题，导致目前产业化应用仍有限制，因此对植物中黄酮的提取、分离的研究逐渐成为热点。本文旨在对总黄酮的主要检测方法以及应用进展进行讨论，以期为相关领域专家学者和行业从业者提供参考。

1 总黄酮提取方法

当前，从植物中提取总黄酮主要有两种方法：一种是比较传统的提取方法，主要包括有机溶剂提取法、水提法等^[17-19]；另一种是比较新型高效的提取方法，如超声辅助提取、超临界流体提取、微波辅助萃取等^[20-22]，这些方法都各有利弊。

1.1 有机溶剂提取法

总黄酮的分离是从植物向溶剂中转移的过程，主要影响因素是黄酮在溶剂中的溶解度。目前常用的有机溶剂包括甲醇^[23]、乙醇^[24-25]、丙酮^[26]等。在有机溶剂中，乙醇安全性能高且易回收，是使用较多的溶剂，多用于索氏提取器中进行加热回流^[27]。廖亮^[28]研究发现经不同预处理、使用不同溶剂和条件提取银杏叶总黄酮，选用乙醇的提取率最佳。秦志华等^[29]用乙醇加热回流法提取构树叶总黄酮，在乙醇浓度70%、反应温度80℃、提取时间2.5 h、料液比1∶30（g∶mL）条件下，效果最佳。张帆等^[30]对比了乙醇加热回流法和超声提取法对芒果叶总黄酮提取率的影响，两种方法得到的总黄酮含量分别为1.8173%和1.6545%，表明了对提取率的产生影响关键在于提取剂的浓度和反应温度，其次为反应时间和料液比。但由于此法耗时长、溶剂用量大、不易操作，且加热温度高，不适用于一些受热易破坏成分的样品

1.2 水提法

黄酮苷类易溶于热水，使用水作为提取剂，安全无毒、成本低廉。刘安军等^[31]使用水提法提取洋葱中的总黄酮，当提取温度为40℃、提取时间5 h、料液比1∶4，在此条件下提取的黄酮占洋葱鲜重的0.17%。刘峥等^[32]研究了水浸提法提取银杏叶总黄酮，确定了最佳水浸提条件为浸提时间为11 h，最佳温度为90℃，最佳提取次数3次。近几年，在热水提取的基础上，加以高压，如王广慧等^[33]、郭晶等^[34]发表的研究成果。但热水极性大，易将溶于热水的杂质提取出来，使得黄酮类物质的得率降低。此外，耗时长、提取次数多、过程烦琐也是此法的缺点。不过由于成本低廉、设备简单、安全环保，水提法仍受到很多科研工作者的青睐。

1.3 超声辅助提取

一般实验室检测总黄酮，多是采用超声辅助乙醇提取。邵越楣等^[35]对比了超声提取法、超声辅助酶提取法和超声辅助双水相提取法对桂花黄酮提取率的影响。结果表明，在温度50℃、液固比17∶1（mL∶g）、乙醇体积分数52%的条件下，经超声提取桂花黄酮的提取率最高。张毅等^[36]对比了3种溶剂、3种提取方式对宣木瓜中总黄酮的影响，结果表明，溶剂为乙醇70%，提取条件为超声或者回流，宣木瓜总黄酮的提取率最高。提取宣木瓜总黄酮时，使用不同的溶剂，用不同的提取方式，结果相差比较大，其中以70%乙醇作为溶剂，用索氏提取，得率最低，另外两种方式得率相差不大。由此可见，超声提取法用时短，提取率高，操作简单，可用于实验室少量的提取和含量测定。

1.4 超临界萃取法

李文馨等^[37]使用超临界CO₂萃取桑枝黄酮，研究了萃取温度、时间、压力和夹带剂流速对桑枝总黄酮得率的影响。在萃取温度40℃、时间45 min、压力45 MPa以及夹带剂流速0.750 mL·min^{- 1}的条件下，桑枝总黄酮得率为2.4817 mg·g^-1。超临界流体萃取在流体介质上的选择很重要，应选择与被萃取物质相近的，这样溶解性才会更高。相对于其他提取技术来说其操作过程容易控制，萃取温度略高于室温，因此可以减少对易挥发性的组分、活性成分、热敏性组分的损失，天然药物中有机物成分的萃取分离较适用于此法^[38]。超临界萃取对技术要求高，仪器规模大，投入资金多，因此在产业化方面还有待考量。

1.5 微波辅助萃取法

微波提取法与超声辅助提取原理相似。李乐等^[39]采用微波辅助法提取关山樱花总黄酮，确定最优提取条件为微波功率400 W，液料比40 mL/g，温度75℃，乙醇浓度50%，总黄酮得率为16.08%。其中，影响结果的主要因素为乙醇浓度，其次为微波功率、温度和液料比。此方法不需要加热回流，操作简便，但由于溶剂和温度受微波影响较大^[40]，所以在实验过程过中控制好微波功率尤为重要。

2 总黄酮测定方法

总黄酮的测定方法主要有紫外可见分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法。多羟基黄酮化合物大多采用分光光度法检测，但是由于酚羟基的颜色干扰，比色法无法准确测定，误差大。薄层色谱法与高效液相色谱法虽然避免了这个干扰，但其在测定中也各有利弊。

2.1 紫外可见分光光度法

采用分光光度法测定总黄酮，主要有4种显色体系：NaNO₂-Al(NO₃)₃/AlCl₃-NaOH和KAc-Al(NO₃)₃/AlCl₃ 4种络合显色体系^[41]。王丽丽等^[42]对比了绿茶、白茶、乌龙茶和红茶中总黄酮含量，用70%甲醇作为提取溶剂，经NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH络合显色体系，用紫外可见分光光度法测定。李莲芳等^[43]在275 nm波长下，以三氯化铝-甲醇为络合显色体系，测定大枣中总黄酮的含量。分光光度法常用于定性与定量检测中，显色明显，灵敏度高，操作简便、快速^[44]。黄酮中的酚羟基的颜色反应特异性差，干扰因素多^[45]，容易产生背景色干扰，使得结果误差偏大。

2.2 薄层色谱法

卢静华等^[46]用双波长薄层扫描法测定金樱子中总黄酮含量，以乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）为展开剂，λ_S = 266 nm，λ_R = 230 nm条件下测定。此方法操作简便、结果准确、重复性好，为后续冬凌草片^[47]等植物总黄酮的检测提供了参考依据。薄层色谱法可以同时测定多个样品，缩短检测时间。

2.3 高效液相色谱法

刘明地等^[48]研究了叶黄花中总黄酮的提取工艺，在浸泡0 h，回流时间3 h，溶剂体积130 mL，乙醇浓度50%，采用C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈∶0.4%磷酸水溶液＝20∶80进行等度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30℃，紫外检测器检测波长360 nm此条件下，目标色谱峰分离效果最好，具有良好的精密度和回收率。目前，高效液相色谱法在黄酮的检测中，使用最多的是C₁₈柱，高效液相色谱法目前能分析80%的有机化合物。

3 问题与展望

优化提取条件和检测方法将成为下一步研究的重点和方向。由于不同种类植物中总黄酮含量差异较大，故对分离、提纯、含量测定的要求也不尽相同。企业在生产过程中应根据提取物的特点选用适合的提取方法，可以采用联合提取法或者不同方法协同使用，进而可以提高黄酮提取率。鉴于目前提取和纯化分离黄酮的方法各有利弊，研究人员可结合各类方法的优点筛选出更优条件。

水提法和溶剂提取法用时长，且提取过程中温度高，使黄酮类化合物容易失去活性，从而降低了对被测物中总黄酮的提取效率。相比而言，超声和微波辅助提取不仅可以缩短提取时间，还可以避免因高温使黄酮失去活性等问题。因此，超声提取法和微波提取法在总黄酮的提取中将成为主要的提取方法。

紫外可见分光光度法目前使用得较多，但是其容易受到其他杂质的干扰，导致定量结果不准确。高效液相色谱虽然存在价格昂贵、仪器操作难度较大、维护成本高、一般实验室难以配备等问题。但由于其在定性、定量方面显示出较大的优越性，其分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好，能分析和分离高沸点且不能气化的热稳定差的生理活性物质，利用它来研究植物中总黄酮含量将成为未来的一种选择。

综上所述，以上方法在对植物中总黄酮的提取过程中不具有完全的普适性。笔者认为，探索研究适用性更广泛的方法将成为发展趋势。

本文得到刘军义研究员的悉心指导，在此表示真诚感谢！

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