黄恺 兰清滢 韦娜 刘玉雯 杨昆 汪文龙 司露露 秦富

摘 要 本文建立了检测食用蚕蛹中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺4种酰胺醇类抗生素残留量的液相色谱-串联质谱方法。试样用1%氨水乙腈提取，无水乙酸钠和无水硫酸镁除水，C₁₈吸附剂净化，氮吹干后用纯水复溶。采用0.05%氨水水溶液和甲醇为流动相，经Eclipse Plus C₁₈（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色谱柱分离，在电喷雾离子源正、负离子模式下进行多反应监测（MRM），用同位素内标法定量。实验结果显示，氯霉素在0.025～1.000 μg/L浓度范围内线性相关性良好，相关系数r为0.9990，加标平均回收率为99.1%～108.6%，相对标准偏差（RSDs）为3.3%～7.0%。甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在0.125～5.000 μg/L浓度范围内线性相关性良好，相关系数r≥0.9920，加标平均回收率为89.5%～112.1%，相对标准偏差（RSDs）为3.6%～15.8%。该方法快速、准确，灵敏，适用于食用蚕蛹中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的残留检测。

关键词 蚕蛹；酰胺醇类抗生素；氯霉素；氟苯尼考胺

Determination of Amidoxime Antibiotic Residues in Edible Silkworm Pupae

HUANG Kai¹ LAN Qing-Ying² WEI Na¹ LIU Yu-Wen¹

YANG Kun¹ WANG Wen-Long¹ SI Lu-Lu¹ QIN Fu^1*

Abstract A liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was established for the determination of residues of four acylamide antibiotics, namely chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol and florfenicol amine in edible silkworm pupae. The samples were extracted with acetonitrile containing 1% ammonia water, dehydrated with anhydrous sodium acetate and anhydrous magnesium sulfate, purified with C₁₈ adsorbent, and dissolved in pure water after nitrogen drying. The target compounds were separated by Eclipse Plus C₁₈ (2.1 mm×100 mm, 1.8 μm) chromatographic column under the mobile phase of 0.05% ammonia aqueous solution and methanol, detected by multi-reaction monitoring (MRM) under positive and negative ion modes of electric spray ion source, and quantitative analyzed by isotope internal standard method. The experimental results show that chloramphenicol had a good linear correlation in the concentration range of 0.025-1.000 μg/L. The correlation coefficient (r) was 0.9990. The average recovery rate of chloramphenicol was 99.1%-108.6%, and the relative standard deviations (RSDs) were 3.3%-7.0%. Thiamphenicol, florfenicol and florfenicol amine had a good linear correlation in the concentration range of 0.125 μg/L to 5.000 μg/L. The correlation coefficients were≥0.9920. Their average recovery rates were 89.5%-112.1%, and RSDs were 3.6%-15.8%. This method offers rapid, accurate, and sensitive detection, making it suitable for the analysis of the aforementioned antibiotics in edible silkworm pupae.

Keywords silkworm pupae; amide alcohol antibiotics; chloramphenicol; florfenicol amine

基金项目：南宁市科学研究与技术开发计划项目（20212148）

第一作者：黄恺（2000—），男，汉族，福建南安人，本科，助理工程师，主要从事食品安全检测与研究工作，E-mail: huangkai1787@163.com

通信作者：秦富（1987—），男，汉族，广西玉林人，硕士，工程师，主要从事食品安全检测与研究工作，E-mail: 514623946@qq.com

1. 南宁海关技术中心 南宁 530201

2. 南宁师范大学 南宁 530100

1. Technical Center of Nanning Customs District, Nanning 530201

2. Nanning Normal University, Nanning 530100

蚕蛹是鳞翅目蚕蛾科家蚕的蛹，是丝绸产业的副产物。蚕蛹中含有丰富的氨基酸、蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素等营养成分，具有很高的营养价值和药用功能^[1-2]。蚕蛹除了可以直接烹调食用外，还可以加工制成蚕蛹罐头、蚕蛹糖果、蚕蛹饼干和蚕蛹蛋白粉等食物。家蚕养殖过程中容易受败血病、脓病、空头病等细菌病的侵扰，需要使用恩诺沙星、多菌灵、红霉素、氟苯尼考、甲砜霉素等蚕用药物^[3]。其中，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考作为酰胺醇类抗生素对蚕蛹的败血病具有良好的防治效果，但也是容易被养蚕者过度使用的高风险药物^[4]。酰胺醇类抗生素对人体具有严重的毒副作用，其中氯霉素毒性最高，可引起视力损伤、再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病^[5]，在动物养殖过程中属于禁用药物。氟苯尼考和甲砜霉素虽然毒性相对较低，但是大量使用同样会对人体免疫和胚胎造成损伤^[6-7]，其在动物源性食品中的残留量有着严格的限制要求。氟苯尼考胺是氟苯尼考的一种代谢物，是GB 31650—2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》^[8]中规定检测氟苯尼考时需要同时检测的残留标志物。目前，检测食品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考及其代谢物的方法标准^[9-11]有很多，但是国内外缺少针对蚕蛹中抗生素残留的相关研究报道，因此急需建立一种检测蚕蛹中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺残留的可靠方法。

本文以蚕蛹为样本，以家蚕养殖过程中最常使用的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物为检测对象，通过探索和优化其质谱参数、液相色谱条件、定量方法以及分散固相萃取净化程序等，建立了分散固相萃取-液相色谱-串联质谱测定食用蚕蛹中酰胺醇类抗生素残留量的方法，为食用蚕蛹的风险监测和监督抽检提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

液相色谱仪（1290infinityⅡ，美国Agilent公司）；质谱仪（ABsciex QTRAP4500，美国AB SCIEX公司）；飞鸽离心机（DL-5-B，上海安亭科学仪器厂）；台式离心机（湘仪L-420，湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；多功能振荡器（YAMATO-SA300，日本Yamato公司）；超纯水系统（Milli-Q，美国Millipore公司）；电子天平（XS204，瑞士Mettler toledo公司）；数控超声波清洗器（KQ-400DE，昆山市超声仪器有限公司）；氮气浓缩装置（KL512J，北京康林科技有限公司）；多功能旋涡混合器（VOTEX-GENIE2，美国Scientific Industries公司）；Eclipse Plus C₁₈色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美国Agilent公司）；HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美国Waters公司）；0.22 μm疏水性针式滤器（上海安谱实验科技公司）。

1.2 主要试剂

氯霉素标准品（纯度为99.8%）、甲砜霉素标准品（纯度为99.3%）购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；氟苯尼考、甲砜霉素-D3、氟苯尼考-D3和氟苯尼考胺-D3标准品，浓度均为100.0 mg/L，购自广州硕谱生物科技有限公司；氟苯尼考胺和氯霉素-D5标准品，浓度均为100.0 mg/L，购自上海安谱实验科技有限公司；十八烷基键合硅胶吸附剂（C₁₈）、N-丙基乙二胺（primary cecondary amine，PSA，40～63 μm）购自德国CNW公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷（均为色谱纯）购自美国Tedia公司；氨水、无水乙酸钠、无水硫酸钠、无水硫酸镁、中性氧化铝（均为分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司；实验用食用蚕蛹样品购自当地市场。

1.3 样品前处理

称取5.00 g已均质的蚕蛹样品置于50 mL具塞聚丙烯离心管中，加入适量同位素内标，加入20 mL 1%氨水乙腈，涡旋振荡2 min，加入0.5 g无水乙酸钠和2.0 g无水硫酸镁，立即振荡混匀，于水平振荡器上振荡提取20 min，以4000 r/min离心5 min。移取2 mL上清液置于15 mL聚丙烯离心管中，加入0.15 g无水硫酸镁和0.2 g C₁₈，涡旋振荡5 min，以4000 r/min离心5 min，取1 mL上清液于15 mL聚丙烯离心管中，在45℃水浴条件下氮吹干，加入1 mL水复溶，涡旋混匀30 s，过0.22 μm疏水性PTFE针式滤器装入进样瓶，供仪器分析。

1.4 仪器条件

1.4.1 质谱条件

电离方式：电喷雾电离正、负离子模式（ESI+、ESI-）；检测模式：多反应监测（MRM）；气帘气压力：30.0×10⁵ Pa；碰撞气：Medium；离子源电压：正负均为4500 V；离子源温度：500℃；雾化气压力：50×10⁵ Pa；辅助加热气压力：50×10⁵ Pa；

1.4.2 液相色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱温40℃。流动相A为0.05%氨水水溶液；B为甲醇；以0.25 mL/min进行梯度洗脱。梯度洗脱程序为：0～1.0 min，保持5% B；1.0～5.5 min，5% B升至90% B；5.5～7.0 min，升至95% B；7.0～7.1 min，降至5% B；7.1～8.0 min，保持5% B；进样量为5 μL。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

2.1.1 目标物的质谱参数优化

用1∶1甲醇水分别配制1 μg/mL甲砜霉素、氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的单标溶液。在质谱针泵采集模式下，运用Q1 MS模式采集分析各项目的母离子，其中甲砜霉素、氯霉素和氟苯尼考选择信号较高的[M-H]^-离子峰作为母离子，氟苯尼考胺选择[M+H]⁺作为母离子。然后，在Product Iron（MS2）模式下分别选择响应较好的两个子离子作为定量、定性离子，如图1所示。最后，在MRM模式下优化去簇电压（DP）、碰撞能（CE）和碰撞室出口电压（CXP），获得各个项目的最优离子对参数，见表1。其中，氟苯尼考胺离子参数较为特殊，130（m/z）离子实际上来源于子离子230（m/z），属于氟苯尼考胺的孙离子^[12]。因此，当氟苯尼考胺248（m/z）＞230（m/z）受基质干扰较大时，可以选择248（m/z）＞130（m/z）和230（m/z）＞130（m/z）作为离子对。

图1 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的

二级质谱图

Fig.1 Secondary mass spectrums of chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol and florfenicol amine

2.1.2 同位素内标参数的选择

在实验过程中，参照GB 31658.20—2022《食品安全国家标准 动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》^[9]选择同位素内标参数进行定量分析时，发现氟苯尼考和甲砜霉素的线性相关性较差。通过质谱分析发现，该问题主要是所选的内标参数和外标物的同位素质量数相同导致。因为氟苯尼考和甲砜霉素的分子结构中均含有2个氯离子，而氯离子在自然界中存在³⁵Cl和³⁷Cl两种稳定同位素，其丰度分别为75.76%和24.24%，导致氟苯尼考的加合离子峰除了基峰356（m/z）外，还有比较明显的357（m/z）、358（m/z）和359（m/z）同位素峰，其丰度分别是基峰的14.7%、70.2%和10.2%（图3）。因此氟苯尼考-D3的质谱参数不能选择359（m/z）及其子离子，而应选择361（m/z）及其子离子。同理，甲砜霉素质谱参数不能选择356.9（m/z）及其子离子，而应选择358.9（m/z）及其子离子。氯霉素同样含有2个氯离子，所以也有321.9（m/z）、322.9（m/z）和323.9（m/z）等同位素峰，但是由于氯霉素采用的同位素内标是氯霉素-D5，所以不受影响。氟苯尼考胺因不含有氯离子，所以也不受影响。

图2 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的

一级质谱图

Fig.2 Primary mass spectrums of chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol and florfenicol amine

2.2 色谱条件优化

由于氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的极性相对较弱，容易在C₁₈色谱柱上保留，其流动相要求相对较低，而苯尼考胺为碱性物质且极性较强，在色谱柱上的保留、分离和洗脱条件需要进行针对性地优化。本文首先参考国家标准GB 31658.20—2022，以10 mmol/L甲酸铵溶液为水相，分别用乙腈和甲醇作为有机相，对4种抗生素的混合标准液（氯霉素为0.2 μg/L，甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺均为1 μg/L）进样分析，结果发现甲醇作为有机相时各项目的响应值均比乙腈高。再以甲醇为有机相，比较了10 mmol/L甲酸铵溶液、水和氨水水溶液3种水相。结果如图4所示，氨水水溶液作为水相时，氟苯尼考胺峰形锐利、峰高显著提高，保留时间也由1.08 min延长至4.00 min，有效避免了其受极性基质的干扰。然后比较了不同浓度氨水水溶液对目标物的影响，结果显示，氟苯尼考胺在0.05%～1%的氨水水溶液中差异不大，而甲砜霉素、氯霉素和氟苯尼考的响应值随着氨水浓度的增加而有所降低。最后，优化0.05%氨水水溶液与甲醇的初始比例以及洗脱程序后获得较优的色谱条件。在该条件下使用Eclipse Plus C₁₈（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）柱、HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）柱等C₁₈色谱柱，各项目的峰形、响应值和灵敏度均较好。

A: 甲醇+水; B: 甲醇+10 mmol/L甲酸铵水溶液; C: 甲醇+0.05%氨水

图3 不同流动相条件下的提取流色谱图

Fig.3 Extraction flow chromatograms under different mobile phase conditions

2.3 前处理条件优化

2.3.1 提取液选择

动物源性食品中酰胺醇类抗生素的检测方法和标准通常均选择乙酸乙酯作为提取液^[13-15]。由于乙酸乙酯极性较弱，提取极性相对较弱的氯霉素和氟苯尼考效果较好，但是提取极性较强的氟苯尼考胺和甲砜霉素则效果较差。因此，提取过程一方面需要添加氨水来降低酰胺醇类抗生素的极性，另一方面需要多次重复提取来提高提取率。本文选择采用氨化乙腈作为提取液，氨化乙腈为中等极性，既可以兼顾提取强极性的氟苯尼考胺、甲砜霉素和弱极性的氯霉素和氟苯尼考，又可以避免提取到较多的弱极性脂类物质。

2.3.2 净化方法优化

分散固相萃取QuEChERS净化技术广泛应用于食品中农药、兽药等残留量的检测。为了验证该方法适用于蚕蛹中酰胺醇类抗生素的提取净化，本文首先采用不含基质的标准溶液作为模拟样品，加入1%氨化乙腈后，分别加入无水硫酸镁、无水硫酸钠、无水乙酸钠及其组合进行振荡提取、离心后取上清液氮吹复溶进样（以未加入以上吸水剂的提取液组作为对照组）。

结果显示，在提取过程中加入无水硫酸镁、无水硫酸钠、无水乙酸钠及其组合时，各项目的峰面积与对照组比较无显著差异。然后，分别取对照组提取液至4组洁净离心管中，每管2 mL，其中1组不做处理（未处理组），其他3组分别加入C₁₈、PSA、中性氧化铝。各组经振荡、离心后，取上清液氮吹复溶进样，计算各组中各目标物的峰面积与未处理组相应目标物的峰面积之比（未处理组为100%）。结果如图4所示，与未处理组相比，PSA组中尽管甲砜霉素和氟苯尼考的峰面积均大于80%，但氯霉素和氟苯尼考胺的峰面积相对比均低于50%，不满足定量要求。中性氧化铝组中4种目标物的峰面积相对比均低于70%，其中氯霉素只有19.4%，不满足定量要求。C₁₈组中4种目标物的峰面积相对比为96.6%～118.7%，均满足定量要求。最终，本文选择无水硫酸镁和无水乙酸钠作为盐析萃取剂，选择无水硫酸镁和C₁₈为净化吸附剂，对添加不同浓度目标物的蚕蛹样品进行方法验证。结果如表2所示，在不用同位素内标进行校正的情况下，氟苯尼考胺在1 μg/kg、2 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg浓度水平下的平均加标回收率范围为66.1%～69.4%，而氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考在1 μg/kg、2 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg浓度水平的平均加标回收率范围为81.4%～101.3%。结果表明，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考采用溶剂外标法定量即可满足方法定量的要求，而氟苯尼考胺因回收率偏低，需要使用内标法或基质匹配外标法定量。

图4 不同净化填料对乙腈中目标物的影响

Fig.4 The effects of different purification fillers on target substances in acetonitrile

2.4 方法学考察

2.4.1 基质效应分析

为了进一步验证本方法的净化效果和分析氟苯尼考胺回收率偏低的原因，需要对4种目标物的基质效应（Matrix Effect，ME）进行评估。本文采用“直接比较法”计算ME值，即将空白基质液中目标物响应值B与纯溶剂中相同浓度目标物的响应值A进行比较，ME = (B-A)/A×100%。评估结果显示，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的基质效应分别为-6.9%、-5.3%、-4.6%、-34.6%。结果表明4种目标物的基质效应均为抑制效应，其中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的基质效应较小，对结果定量影响较小。而氟苯尼考胺的基质效应较大，是导致方法绝对回收率偏低的主要原因。为了确保4种目标物定量结果的准确和可靠，本文采用同位素内标法对4种目标物的检测结果进行定量。

2.4.2 方法检出限及定量限

通过在空白样品中添加一系列低浓度水平的目标物按照本方法进行检测分析，将信噪比（S/N）不低于3和10的最低浓度作为方法的检出限和定量限，最终确定氯霉素的检出限和定量限分别为0.1 μg/kg和0.2 μg/kg，甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的检出限和定量限分别为0.5 μg/kg和1 μg/kg。

2.4.3 线性范围、回收率及精密度

分别按照各目标物的1倍、2倍、5倍和10倍定量限对空白样品进行加标回收试验，每个浓度设置6个平行，采用溶剂内标法定量，考察方法的回收率和精密度。结果如表3所示，氯霉素在0.025～1.000 μg/L浓度范围内，线性相关性良好，相关系数r为0.9990，在0.2 μg/kg、0.4 μg/kg、1 μg/kg、2 μg/kg浓度加标水平的平均回收率为99.1%～108.6%，相对标准偏差（RSD）为3.3%～7.0%。甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在0.125～5.000 μg/L加标范围内，线性相关性良好，相关系数r≥0.9920，在1 μg/kg、2 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg浓度加标水平的平均回收率为89.5%～112.1%，相对标准偏差（RSD）为3.6%～15.8%。结果表明，本方法各项目的加标回收率和精密度均满足国家标准GB 5009.295—2023《食品安全国家标准 化学分析方法验证通则》^[13]的要求。

3 结论

本文以食用蚕蛹为样品基质，以氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺4种酰胺醇类抗生素为检测对象，通过优化质谱条件、液相色谱条件、样品前处理净化方法等，建立了同时检测食用蚕蛹中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的液相色谱-串联质谱方法。该方法的提取和净化步骤较简单，只需要少量试剂和C₁₈吸附填料进行一次性提取和净化，即可实现较高的准确度和灵敏度。在本方法中，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考采用溶剂外标法和内标法均可满足定量要求，氟苯尼考胺因采用溶剂外标法定量时回收率偏低，所以需要采用内标法或者基质匹配外标法定量。

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表1 4种抗生素项目及其内标的质谱参数

Table 1 Mass spectrometry parameters of four antibiotic items and their internal standards

注: *为定量离子对; **为孙离子.

表2 4种目标物的线性、回收率和精密度（外标法检测）

Table 2 Linearity, recovery, and precision of four target substances (external standard method)

表2（续）

表3 4种目标物的线性、回收率和精密度（内标法检测）

Table 3 Linearity, recovery, and precision of four target substances (internal standard method)