麻晓莉

摘 要 本文比较了平板计数法、凝胶型菌落总数测试片法和无纺布型菌落总数测试片法对检测不同类型样品中菌落总数结果的差异。通过比较大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌标准菌株分别在平板计数琼脂、凝胶型菌落总数测试片和无纺布型菌落总数测试片3种培养基中的菌落形态，并采用这3种方法对2种食品样品Y628和A530进行菌落总数测定和数据分析，确保检验结果的准确性。实验结果显示，凝胶型菌落总数测试片在菌落辨识度上优于平板计数琼脂和无纺布型菌落总数测试片，对于不同样品的检测，结果更易于判读和计数。采用凝胶型菌落总数测试片和无纺布型菌落总数测得的结果与平板计数琼脂测得的结果无显著差异。利用传统平板计数法与市面上不同类型的菌落测试片法对样品Y628和A530的菌落总数进行测定，结果并没有显著性差别，因此菌落总数测试片也可作为上述食品的菌落总数测定。

关键词 菌落总数；平板计数法；菌落测试片；不同类型样品；配对t检验

Comparative Analysis of the Results of Plate Counting Method and Test Plate Method for the Total Colony Count of Various Food

MA Xiao-Li ¹

Abstract This paper compares the differences in the results of plate counting method, gel-based colony counting test piece and non-woven colony counting test piece for detecting colony counts in different types of samples. The colony morphology of standard strains of Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis were compared in three types of media, namely, plate count agar, gel-type colony count test piece and non-woven colony count test piece, respectively. The colony counts of Y628 and A530 food samples were determined by the three methods, and data were analyzed to ensure the accuracy of the test results. The results show that the colony identification of gel colonies is better than that of agar and non-woven colonies, and the results are easier to read and count in different samples. The results obtained using the total number of gel-type colonies and the total number of non-woven colonies are not significantly different from the results obtained by plate count of agar. There is no significant difference between the traditional plate counting method and different types of colony test tablets on the market to determine the total number of colonies of samples Y628 and A530. Therefore, the colony test piece method can be used to determine the total number of colonies in the food mentioned above.

Keywords total count of colony; plate counting; colony test plate; different types of samples; paired t-test

第一作者：麻晓莉（1985—），女，汉族，广西灵山人，本科，工程师，主要从事食品微生物检验工作，E-mail: 63676383@qq.com

1. 南宁海关技术中心 南宁 530021

1. Technical Center of Nanning Customs District, Nanning 530021

食品安全对公众的日常生活有着重大影响，它不仅关乎公众的身体健康，也影响到公众的生活质量。伴随着中国经济的飞速增长，公众生活品质的提升，对于食品的安全性有了更高的要求^[1]。微生物检测是保障食品安全的关键。菌落总数是指食品样品在特定的培养基、适宜的培养温度、培养时间等条件下，得到的每g (mL) 样品中的细菌数量^[2]。在食品生产、加工、运输、储藏等各个阶段，微生物含量变化是衡量食品卫生质量的一个重要指标。近年来，我国食品安全监督抽查发现部分食品中检出菌落总数超出标准^[3]。

菌落数量的增多将加快食物的腐坏过程，降低食物的食用价值。人体摄入超过标准的食物后，可引起多种消化道疾病，严重者可致呕吐、发热、腹泻等，危害人体健康^[4]。因此，微生物检验人员必须熟悉食品中菌落总数的测定方法和操作规程，以期为市场监管评估工作提供可靠、有效的数据支持，从而保护消费者的利益^[5]。

当前，美国官方分析化学家学会（Association of Official Agricultural Chemists，AOAC）《食品中细菌总数的检测再水化干膜法》、加拿大MFHPB-33（MFHPB-33）均使用菌落试纸来测定食品及奶粉中的菌群。近年又有学者进行了菌落试纸与平板计数法的比较^[6]，并据此研发了一种新的菌落试纸^[7-9]，但相关研究尚处于起步阶段。由于平板计数法对常规的菌落总数的测定方法比较烦琐且耗时较长，给实验操作带来了不便。根据GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》增加使用菌落总数测试片方法，测试片应按照相关技术规程操作。目前，国际上已开展了多种食品中微生物的快速检测技术研究，其中以纸片法代替常规的平板法成为食品生产厂家和检验单位的首选^[10]。

本研究以大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、枯草芽孢杆菌ATCC6633为质控菌种，参照GB 4789.28—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》，用菌落测试片法和平板计数法分别测量2份样品中的菌落总数，并将其进行统计分析，对比3种方法在不同样品中所测得的结果，为制定相应的标准提供参考^[10]。

1 材料与方法

1.1 样品来源

待测样品为实验室2份能力验证样品，样品编号分别为Y628和A530。

标准菌株：大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、枯草芽孢杆菌ATCC6633。

1.2 培养基及试剂

平板计数琼脂培养基（Plate Count Agar，PCA；北京陆桥公司，220322）；凝胶型菌落总数测试片（美国3M公司，33PK43）；无纺布型菌落总数测试片（日本岛津公司）。

1.3 仪器与设备

恒温恒湿培养箱（HCP246，德国美默尔特）；高压蒸气灭菌器（HV-85，日本Hirayama）；生物安全柜（Hfsafe 1200A2，上海力申科学仪器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 实验准备

培养基配制：根据生产商的配制说明书指示，需要按照特定的比例来配制平板计数琼脂。121℃下进行15 min的高压灭菌后，在46℃的恒温水浴箱中保持恒温。凝胶型菌落测试片从冰箱中取出，待其恢复到室温后再使用。

样品前处理：将西林瓶放置在生物安全柜里，待恢复室温后无菌操作将其打开。吸取5 mL磷酸盐缓冲液加入其中，使其完全溶解后转移到500 mL的无菌三角瓶中。使用剩余的55 mL的磷酸盐缓冲液对西林瓶的内壁进行3次清洗，并将所有的清洗液都收集起来，放置于上述500 mL的无菌三角瓶里，摇晃均匀，即得到测试样品原液。

菌液制备：从菌种储存管中取出大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌各1个瓷珠，将它们分别加入到新鲜的100 mL营养肉汤中，在36℃下培养24 h，得到菌悬液。对菌悬液进行倍比稀释，使其最终浓度在30～100 CFU/mL之间。

1.4.2 样品稀释

充分混匀测试样品原液，用1 mL灭菌吸量管吸取1 mL原液，沿管壁徐徐注入含有9 mL磷酸盐缓冲液的试管中，采用涡旋震荡器将1∶10的样品液体震荡均匀。另取1 mL灭菌吸量管吸取1 mL 1∶10的样品匀液，将其注入9 mL磷酸盐缓冲液的试管中，制成1∶100的样品匀液。根据前面的步骤，逐级进行10倍系列稀释，最终制备出10^-1～10^-3的样品稀释液。在进行10倍递增稀释过程中，需要同时将1 mL样品匀液加入无菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。每次试验过程中设置稀释液空白对照，空白对照做2个平皿。

1.4.3 检测方法

平板计数法：通过无菌方法取出25 g（或25 mL）样品，将其放入装有225 mL无菌磷酸盐缓冲液的灭菌三角瓶中（瓶内预设适量的玻璃珠），进行充分摇晃，这样就得到1∶10 （m∶V， V∶V，下同）样品的均匀稀释液；或将其放入装有225 mL无菌磷酸盐缓冲液的均质袋内，利用拍击式均质器进行2 min拍打，以此得到1∶10稀释液。依据样品的种类来决定最佳的稀释度，以确保平板上的菌落数量处于30～300 CFU/mL的范围。

菌落测试片法：按照说明书的指示，将测试片置于光滑的实验台上，揭开上层膜或者盖子，从预先准备的样品匀液中，各吸取1 mL滴加到2张凝胶型菌落测试片和2张无纺布型菌落测试片中央，覆盖好菌落测试片，静置3～5 min使样液扩散，并在（36±1）℃的环境下进行（48±2） h的培育。

对标准菌株加样处理：从上述3种菌悬液中各取1 mL，利用平板计数法和菌落测试片法逐步稀释并进行加样培养，同时进行平行对照。

1.4.4 统计分析方法

将同一样品中平板和菌落测试片的计数结果均在30～300 CFU/mL的数据，采用对数值，利用SPSS 26.0软件进行分析，通过配对t检验确定平板计数法与菌落测试片法的检测结果之间的差异，是否具备统计学意义。如果p＜0.05，差距有统计学意义，即差异显著。

2 结果与分析

2.1 3种菌株在不同培养基上的菌落分析

大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌在不同培养基上的菌落形态如图1、图2、图3所示，从左至右分别为平板计数琼脂、凝胶型菌落总数测试片、无纺布型菌落总数测试片。大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌在平板计数琼脂上均呈白色点状，金黄色葡萄球菌所形成的菌落更小；金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌在凝胶型菌落总数测试片和无纺布型菌落总数测试片均形成红色边缘清晰的点状菌落。而枯草芽孢杆菌在平板计数琼脂上的菌落形态，部分是圆形白色点状或近圆形的白色菌落，部分则是白色较大、不规则的、边缘不整齐的，甚至有向外延伸趋势的菌落；在凝胶型菌落总数测试片上形成了红色圆形、边缘模糊的菌落；在无纺布型菌落总数测试片上形成的红色菌落边缘模糊、不规则，有的甚至有很长的拖尾。

2.2 平板计数法与不同类型的菌落测试片法检测结果与分析

本研究采用食品中菌落总数能力验证检测样品Y628和A530，分别用平板计数琼脂、凝胶型菌落总数测试片和无纺布型菌落总数测试片3种方法检测，菌落总数检测结果见表1、表2。对于相同的样品，使用3种不同的检测手段所获得的结果大致上是相等的。菌落数测定结果与稀释倍数成反比关系，并且相同稀释度的样品中差异不大，表明实验结果相对准确。无菌落生长的空白对照显示出，实验过程没有受到污染，因此实验结果有效。样品Y628在10^-1稀释条件下，菌落数超出300 CFU，被定义为“多不可计”，在10^-3稀释条件下，菌落数少于30 CFU，在10^-2稀释条件下的菌落数符合30～300 CFU计数标准。样品A530在10^-3稀释条件下菌落数少于30 CFU，在10^-1和10^-2有2个连续稀释条件符合30～300 CFU计数要求。

将上述3种方法得出的菌落计数结果，采用对数值后进行配对t检验，把菌落数经过计算处理后显示p＞0.05，表明3种检测方法得出结果无显著差异。

2.3 能力验证结果分析

能力验证评估的结果如表3所示，其中|z|≤2.0的能力评估标准为满意；如果0＜|z|＜3.0，则显示出可疑的结果；当|z|≥3.0，则不能得到令人满意的结果。样品Y628和A530分别为0.2和0.9，都＜2.0，性能评定为令人满意。其中，|z|值偏大的原因有两方面：一是培养周期太长，本实验以48 h为单位进行，在计数过程中，出现了一些菌落相连，影响了计算的准确性。二是不包覆培养基，计数时见菌落扩散，从而降低了计数的准确度。另外，样品A530从样品原始稀释到倾注过程未在15 min内完成，导致菌落数有所增殖。

3 结论与讨论

本研究采用试验方法，探讨了平板计数和不同类型测试片3种检测方法在食品检测中的应用。通过对3种方法的对比分析，凝胶型菌落总数测试片在菌落辨识度上优于平板计数琼脂和无纺布型菌落总数测试片，对于不同样品的检测，结果更易于判读和计数。采用凝胶型菌落总数测试片和无纺布型菌落总数测得的结果与平板计数琼脂测得的结果无显著差异，均具有一定的实用价值。

在应用平板计数法时，由于存在多个梯度，需使用更多的平板，这会占用大量空间。目前，大部分实验室受场地限制，无法购置更多的培养箱进行培养，还得预先配制培养基，这个过程需要大量的手工操作，从而增加了实验的工作量。然而，由于这种方法具有较高的准确度和价格优势，有助于节约成本，因此被广泛用于食品检验中。

与平板计数法相比，测试片法克服了传统的测试方法存在的由于使用不同批次的培养基、不同的配制条件、不同配制人员而导致的差异性。它是一种快速、便捷的方法，可有效提高检测效率，降低人工成本。该方法以等厚的薄片为主体，按所需的分析梯度来布置相对应的薄片，占用空间小。这种方法在准确度上虽没有平板计数法高，试剂成本为传统方法每皿平板计数琼脂的数十倍，但在操作和结果判定上比较简单，简化了操作流程，缩短了检测时间，因此与当前很多实验室相适应。为提高检测效率，提升检测质量，应结合实验的准确度及其他相关条件，选取符合实验室要求的测量方法。

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图1 大肠埃希氏菌标准菌株在不同培养基上的菌落形态

Fig.1 Colony morphology of Escherichia coli standard strains on different media

图2 金黄色葡萄球菌标准菌株在不同培养基上的菌落形态

Fig.2 Colony morphology of standard Staphylococcus aureus strain on different media

图3 枯草芽孢杆菌标准菌株在不同培养基上的菌落形态

Fig.3 Colony morphology of standard strains of Bacillus subtilis on different media

表1 3种方法对Y628样品的检测结果

Table 1 Test results of Y628 samples by three methods

表2 3种方法对A530样品的检测结果

Table 1 Test results of A530 samples by three methods

表3 能力验证样品评价结果

Table 3 Evaluation results of capability verification samples