孟媛 苏小建 杨国平 蔡丽萍 张荣 易海华 田锋 耿合员

摘 要 本文旨在探索利用飞行时间质谱MALDI-TOF MS快速鉴定江苏口岸输入性病媒生物蜚蠊携带致病菌种类特征，为防控蜚蠊携带致病菌提供技术指导。通过将口岸截获的输入性病媒生物蜚蠊组织研磨后进行细菌培养，对单一菌落分别通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight，MALDI-TOF MS）法进行鉴定，以检测蜚蠊携带致病菌种类特征。结果显示，通过MALDI-TOF MS法鉴定出蜚蠊携带的菌群主要是革兰阴性杆菌，包括肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca，Kox）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PAE）、大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）及其亚型等。少数为携带革兰阳性菌，包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，MRSA）及其他革兰阳性葡萄球菌的亚型、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）及其他芽孢杆菌等。综上，MALDI-TOF-MS法可实现对口岸输入性病媒生物蜚蠊携带致病菌的快速鉴定，为口岸输入性蜚蠊携带传播疾病的防控提供技术支持。

关键词 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；蜚蠊；口岸输入；致病菌

Rapid Identification of Pathogenic Bacteria Carried

by Imported Cockroaches at Jiangsu port

Using MALDI- TOF MS M ethod

MENG Yuan¹ SU Xiao-Jian¹ YANG Guo-Ping¹ CAI Li-Ping²

ZHANG Rong¹ YI Hai-Hua¹ TIAN Feng³ GENG He-Yuan^1*

Abstract This study aims to explore the rapid identification of the pathogenic bacteria carried by cockroaches, an imported vector species at Jiangsu ports, using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS), to provide technical guidance for the prevention and control of cockroaches. By grinding the tissues of intercepted imported vector cockroaches and culturing the bacteria, we identified individual colonies using MALDI-TOF MS to detect the species characteristics of pathogenic bacteria carried by cockroaches. According to the result of MALDI-TOF MS, the main bacteria carried by cockroaches were Gram-negative bacilli, including Klebsiella pneumoniae (KPN), Klebsiella oxytoca (Kox), Pseudomonas aeruginosa (PAE), Escherichia coli (E.coli), Proteus mirabilis and their subtypes. A minority were Gram-positive bacteria, including Staphylococcus aureus (MRSA) and other Gram-positive staphylococcus subtypes, Bacillus cereus and other bacillus species. These findings indicate that MALDI-TOF-MS method can achieve rapid identification of pathogenic bacteria carried by imported vector-borne cockroaches at ports, and provide technical support for the prevention and control of imported vector-borne diseases.

Keywords Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS); cockroach; imported; pathogenic bacteria

基金项目：国家重点研发计划（2021YFC2301200）；海关总署科研项目（2023HK03）；南京海关科研项目（2022KJ15，2023KJ02）

第一作者：孟媛（1994—），女，汉族，山东济宁人，本科，医学检验技术师，主要从事卫生检验工作，E-mail: 2765258392@qq.com

通信作者：耿合员（1984—），男，汉族，山东聊城人，博士，副主任技师，主要从事口岸卫生检疫和病毒病原生物学研究工作，E-mail: ghy-08@163.com

1. 江苏国际旅行卫生保健中心（南京海关口岸门诊部） 南京 210019

2. 常熟海关综合技术服务中心 常熟 215500

3. 新疆国际旅行卫生保健中心（乌鲁木齐海关口岸门诊部） 乌鲁木齐 830011

1. Jiangsu International Travel Health Care Center (Nanjing Customs Port Outpatient Department), Nanjing 210019

2. Changshu Customs Comprehensive Technical Service Center, Changshu 215500

3. Xinjiang International Travel Health Care Center (Urumqi Customs Port Outpatient Department), Urumqi 830011

蜚蠊是口岸监测的重要病媒生物之一，国内外对蜚蠊及其危害进行了相关研究，并从其体内和体表分离出多种病原体^[1-4]，包括细菌、病毒、原虫、寄生虫等，严重威胁着人类健康。我国边境口岸众多，对外贸易往来也日益频繁，蜚蠊等病媒生物易经口岸通过船舶、集装箱、航空器等交通工具传入。常见的口岸输入性蜚蠊类病媒生物包括德国姬蠊（Blattella germanica）、日本姬蠊（Blattella nipponica）、美洲大蠊（Periplaneta americana）、澳洲大蠊（Periplaneta australasiae）、褐斑大蠊（Periplaneta brunnea）、日本大蠊（Periplaneta japonica）、广纹真姬蠊（Eublattella latistriga）等^[5]。江苏口岸输入性病媒生物蜚蠊大多来自马来西亚、印度尼西亚等热带及热带雨林气候的国家及地区，常见种类为德国小蠊，少数为美洲大蠊、广纹小蠊等^[6]。德国小蠊喜欢发酵食物，美洲大蠊爱吃腐败食品和饮料，它们的肠道内或者体表机械性携带致病菌群或寄生虫可导致传染病及寄生虫病发生，如霍乱弧菌、阿米巴痢疾感染导致严重腹泻呕吐，肺炎克雷伯菌感染心肺导致心慌、畏寒、剧烈咳嗽等症状，可破坏口岸公共卫生环境，危害人类健康^[7-10]。因此，建立健全口岸病媒生物监测体系，提高对境外病媒生物及传染病的风险与识别意识，对维护国门生物安全和公众健康意义重大。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight，MALDI-TOF MS）是一种新型软电离生物质谱^[11-12]，其原理是将菌种加入基质液后，形成一个共同结晶体，在激光照射时，结晶体中的蛋白分子电离，在静电场中被加速，到达离子检测器，通过质荷比的采集可获取细菌蛋白指纹图谱，与数据库中的菌种标准图谱进行对比，最终得到完整的菌种鉴定结果，该鉴定结果有时能达到属、种和分型水平^[13]。在MALDI-TOF MS法中，用于进行荷质比分析的蛋白分子主要是细菌体内成分较为稳定、峰度较高的蛋白。正是利用细菌特有的高分子蛋白质具有稳定、峰度高这一特性，MALDI-TOF MS法可以快速鉴定出细菌菌种^[14-15]。与微生物检测中常用的生化实验相比，有效缩短了检测时间，弥补了微生物检测中鉴定时间长、操作烦琐的短板，同时具备更高的准确度和更强的可重复性，并且适用于多样本的快速鉴定。因此，MALDI-TOF MS法目前被广泛应用和关注^[16-18]。本研究以MALDI-TOF MS法为基础，针对2023年海关于江苏口岸截获的输入性蜚蠊开展病原体检测研究，以期为口岸进境蜚蠊携带传播病原体防控提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 样本来源

收集2023年1—12月来自南京禄口国际机场、新生圩、张家港、太仓、南通、常州、无锡、连云港、常熟、泰州、江阴、盐城、如皋等江苏省空港及港口送检蜚蠊类样本共计1200只。

1.2 材料与试剂

培养基（营养琼脂平板），购于广东环凯有限公司；校准菌株大肠杆菌ATCC8739，购于广东环凯有限公司；VITEK MS-CHCA基质液，购于梅里埃公司；VITEK MS甲酸溶液购于梅里埃公司；一次性接种环，一次性取样环。

1.3 仪器设备

高通量研磨器，购于凯杰有限公司；恒温恒湿箱（HWS-250B），购于德国BINDER公司；质谱鉴定仪（VITEK MS），购于梅里埃公司；生物安全柜（BHC-1300A2），购于美国赛默飞公司 。

2 方法

2.1 样本处理

将送检蜚蠊样本按种类分类后进行病原检测，对数量较多的按照5～10只为一批次进行编号，共计124批次。将蜚蠊分批次分别放入1.5～2 mL无菌管中，加入无菌钢珠和生理盐水后置于高通量研磨器中快速研磨5～10 min。

2.2 细菌培养

按编号批次用无菌棉签分别蘸取经振荡混匀后的匀浆样品，均匀涂在培养皿的1/3部分的作为一区，用一次性接种环接种二区和三区（三区划线培养法），放入培养箱于37℃进行24 h培养。

2.3 检测方法

用一次性挑取环挑取第三区中的单个菌落均匀涂在靶板孔，加入1 μL VITEK MS甲酸溶液自然风干，再覆盖1 μL VITEK MS-CHCA基质液，放置平台风干，同时打开软件VITEK MS Prep Station，编辑标本编号及靶板号发送至质谱工作站（VITEK MS Acquisition Station）完成上机操作。采用数据分析软件Myla4.9版本对形成的图谱进行数据的匹配和分析，置信度达到80%～99.9%的进行结果可行性分析和报告发送。

3 结果

3.1 种类鉴定

通过对江苏20余个口岸送检的蜚蠊进行形态学鉴定，发现所收集的1200只蜚蠊中，德国小蠊有1151只，占总数的95.92%。在送检样本中，除德国小蠊外，还在张家港口岸发现美洲大蠊（15只）、澳洲蜚蠊（13只），在常州口岸发现美洲大蠊（2只），在如皋口岸还发现了美洲大蠊（7只），在淮安口岸发现广纹小蠊（1只），在南通口岸发现日本大蠊（2只）。江苏口岸收集的蜚蠊样品中，共鉴定出德国小蠊、美洲大蠊、广纹小蠊等共5种，以德国小蠊为主要输入性病媒。

3.2 微生物检测

通过MALDI-TOF MS法对蜚蠊携带病原体分批次进行鉴定。在124批次中检测出带菌病媒共116批次，检出率达93.55%。其中，革兰氏阴性菌检出89批次，占检出率的76.72%，其余批次检出革兰氏阳性菌。

检出的主要是革兰阴性杆菌菌群，包括肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌及其亚型等，如图1所示；不同种类的蜚蠊均可携带。此外，鉴定出的革兰阳性菌群包括木糖葡萄球菌及其他革兰阳性葡萄球菌的亚型、蜡样芽孢杆菌及其他芽孢杆菌等（图2），检测结果同样显示不同种类的蜚蠊均可携带。

4 讨论

江苏空港、港口口岸较多，从收集的来自20余个江苏口岸输入性蜚蠊形态鉴定结果表明，德州小蠊为主要输入性病媒，占到各个口岸截获蜚蠊物种的绝大多数，来源主要包括澳大利亚、韩国、巴拿马、伊朗、印度尼西亚、越南、柬埔寨、新加坡、俄罗斯、安哥拉、菲律宾、日本、土耳其、荷兰、阿曼、泰国、阿拉伯联合酋长国、埃及、委内瑞拉、中国台湾等20多个国家及地区。其中，截获的少数其他蜚蠊物种类包括美洲大蠊，来源国主要是柬埔寨和俄罗斯，广纹小蠊来源国为土耳其，澳洲大蠊来源国主要是澳大利亚。

蜚蠊作为江苏口岸重要输入性病媒生物之一，其携带致病菌情况还未见系统性研究，无论是其体表机械携带还是其自身携带的致病菌情况仍不清楚。本文基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS），通过对蜚蠊分批次研磨、划线培养、质谱鉴定等步骤，对江苏口岸输入性蜚蠊携带致病菌进行了系统研究。实验中对蜚蠊体表机械携带致病菌还是体内携带致病菌未作区分，统一做研磨处理后培养，以期通过质谱鉴定法对蜚蠊携带致病菌有整体性认识。此外，因收集的蜚蠊中德国小蠊占大多数（占总数近96%），其他种类蜚蠊数量较少，未对不同种类蜚蠊携带致病菌情况进行区分鉴定。

传统的细菌鉴定方法主要是通过细菌培养和生化鉴定法，基于致病菌间理化指标的不同，利用细菌的产气、产酸及生长代谢等方面特性进行选择性培养来判断，存在检测时间长、操作过程复杂、检测灵敏度低等缺点，限制了检测范围。而应用广泛的PCR检测方法，尽管在检测灵敏度方面有了提高，但存在检测通量小，一次实验往往只能检测一种或少数几种致病菌，无法满足高通量快速检测的需求。

本研究通过质谱鉴定法，实现对蜚蠊携带致病菌高通量快速鉴定，大大节约了检测鉴定的时间和成本，提高了检测准确度。研究结果为江苏口岸输入性蜚蠊携带致病菌提供了参考资料，为防控口岸输入性蜚蠊及其他病媒生物携带的传染病提供技术支持。

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A: 肺炎克雷伯菌; B: 产酸克雷伯菌; C: 铜绿假单胞菌;

D: 大肠杆菌; E: 奇异变形杆菌

图1 革兰氏阴性菌鉴定结果

Fig.1 The results of Gram-negative bacteria identification

F: 木糖葡萄球菌; G: 蜡样芽孢杆菌

图2 革兰氏阳性菌鉴定结果

Fig.2 The results of Gram-positive bacteria identification